李 艷，王思怡，章 微，陳露易，李斐雪

(1. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州311121； 2. 杭州師范大學(xué)理學(xué)院，浙江 杭州 311121)

0 引言

卵巢作為雌性哺乳動物重要的生殖器官，呈卵圓形，位于子宮兩側(cè)，可以釋放成熟的卵母細(xì)胞(oocytes)，還可以合成并分泌類固醇激素如雌激素、孕激素等.卵巢發(fā)育異常會引起多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)及卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)等多種疾病，導(dǎo)致不孕不育[1].目前，建立理想的卵巢異常動物模型成為預(yù)防和治療卵巢疾病的關(guān)鍵所在，也是深入理解和研究卵巢異常發(fā)病機(jī)制、發(fā)展和治療的基礎(chǔ).

圖1 卵泡發(fā)育示意圖Fig.1 Schematic illustration of follicular development

小鼠的卵巢和睪丸都從成對的生殖脊(genital ridge)發(fā)育而來[2].小鼠卵巢內(nèi)存在不同發(fā)育階段的卵泡(follicular)和黃體(corpus luteum).卵泡是卵巢的基本功能單位，從靜止的原始卵泡(primordial follicle)狀態(tài)被激活，經(jīng)過初級卵泡(primary follicle)、次級卵泡(secondary follicle)、有腔卵泡(antral follicle)等階段發(fā)育至成熟卵泡(mature follicle)[3]，其發(fā)育過程見圖1.原始卵泡由一個直徑小于20 μm的卵母細(xì)胞和其周圍單層扁平的前體顆粒細(xì)胞以及外周鞘細(xì)胞組成.在小鼠出生后第3天(P3)出現(xiàn)由立方形顆粒細(xì)胞包圍的初級卵泡.隨著顆粒細(xì)胞不斷增殖，卵泡膜細(xì)胞形成，成為次級卵泡.卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)調(diào)節(jié)從次級卵泡到排卵期前卵泡顆粒細(xì)胞的增殖與發(fā)育[4].次級卵泡的顆粒細(xì)胞分離，其間充滿卵泡細(xì)胞分泌的卵泡液，形成直徑達(dá)70 μm的卵泡腔.出生后第7天(P7)的小鼠卵巢中可見個別有腔卵泡，第21天(P21)時有腔卵泡明顯增多.隨之卵泡液增多，卵泡腔變大，形成成熟卵泡[5].成熟卵泡擴(kuò)展至整個皮質(zhì)部而突出卵巢表面.

黃體生成素(luteinizing hormone，LH)激活卵泡顆粒細(xì)胞中的多個信號通路，使其黃體化，卵丘擴(kuò)展，卵泡壁裂解，卵細(xì)胞被釋放，該過程即為排卵[6].排卵后，顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有分泌功能的粒黃體細(xì)胞，與卵泡膜血管、成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞一起填滿卵泡腔；卵泡膜細(xì)胞分化為周邊的膜黃體細(xì)胞，共同形成黃體[7].黃體的主要功能是產(chǎn)生發(fā)情周期與維持妊娠所需的孕酮(progesterone).若卵細(xì)胞未經(jīng)受精或著床失敗，黃體將經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能的退化，逐漸萎縮變成白體(corpus albicans)，從而失去分泌功能[5].

體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要調(diào)節(jié)蛋白——蛋白激酶，在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、分化、凋亡、代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞運(yùn)動和骨架重排中扮演著重要的角色.人體內(nèi)已知的蛋白激酶有518種，它們負(fù)責(zé)催化磷酸基團(tuán)向蘇氨酸、酪氨酸和絲氨酸轉(zhuǎn)移[8].激酶可以分為常規(guī)激酶和非常規(guī)激酶兩大類.大部分激酶屬于常規(guī)激酶，具備典型的激酶結(jié)構(gòu)，由二級結(jié)構(gòu)上保守的序列組成其催化區(qū)域.非常規(guī)激酶種類較少，在人類基因組中已知的只有40余種.兩類激酶在結(jié)構(gòu)上有的相似有的則差別較大，在序列上不相似，但都有激酶的特征性結(jié)構(gòu).

非常規(guī)激酶RIO(right open reading frame)家族蛋白都有相對保守的RIO結(jié)構(gòu)域[8-10]，其中家族成員Riok1和Riok2最早都在酵母中發(fā)現(xiàn)[9,11].現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)從古細(xì)菌到哺乳動物中都存在Riok1和Riok2，而Riok3則在較高等的真核生物中存在[12].

在酵母細(xì)胞中，Riok1或Riok2任一蛋白激酶的缺失都會導(dǎo)致20S rRNA前體加工受限[11,13].在人體細(xì)胞中，Riok3的缺失會使產(chǎn)生18S rRNA過程中21S rRNA前體水平升高[14].然而，在許多真核生物有機(jī)體中rRNA前體的加工過程是40S 核糖體亞基成熟的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15].因此，RIO蛋白激酶在哺乳動物細(xì)胞核糖體生物合成中扮演著關(guān)鍵角色.

許多核糖體生物合成相關(guān)蛋白在細(xì)胞周期過程中發(fā)揮著重要的作用[16].RIO激酶家族也不例外.Riok1基因敲除能抑制S期細(xì)胞周期進(jìn)程及酵母細(xì)胞的有絲分裂[9,16-17].Riok2是PLK1(polo-like kinase1)的新型靶分子，PLK1介導(dǎo)的Riok2磷酸化能調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞從中期向后期的轉(zhuǎn)換[18].這些研究暗示RIO激酶家族控制細(xì)胞周期過程，對細(xì)胞的生長有潛在作用.

近期本課題組發(fā)現(xiàn)Riok3在小鼠卵巢卵母細(xì)胞中表達(dá)較高.卵母細(xì)胞在卵泡的發(fā)育成熟中意義重大，影響卵巢的發(fā)育.鑒于RIO激酶家族在細(xì)胞周期過程中發(fā)揮重要作用，若使卵母細(xì)胞中Riok3缺失或失活，是否會影響卵泡的發(fā)育導(dǎo)致卵巢早衰？由此，本研究構(gòu)建了Riok3條件基因打靶的小鼠模型，為進(jìn)一步研究Riok3在卵巢發(fā)育中的功能及其分子機(jī)理奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物：本研究中小鼠的飼養(yǎng)和使用參照《杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理辦法》，受杭州師范大學(xué)動物管理委員會的監(jiān)督.所用材料為SPF(specific pathogen free)級別小鼠，購自杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心.實(shí)驗(yàn)用受精卵由健康7周齡C57BL/6J雌鼠30只與雄鼠10只交配而得；假孕母鼠由健康7周齡ICR(Institute of Cancer Research)雌鼠20只與結(jié)扎雄鼠7只交配檢陰栓后而得.

實(shí)驗(yàn)材料：胎牛血清(Gibco，10099-141)，非必需氨基酸 (Gibco，11140-050)，丙酮酸鈉 (Gibco，11360-070)，谷氨酰胺(Gibco，35050-061)，青霉素-鏈霉素(Gibco，15140-122)，0.05%胰酶-EDTA(Gibco，25300-054)，DMEM(Gibco，11960-069)，DPBS(Gibco，14190-250)，ESGRO mLIf(Millipore，ESG1107)，M16(Sigma，M7292)，干細(xì)胞129細(xì)胞系W4,來源于杭州師范大學(xué)張遵義教授實(shí)驗(yàn)室.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原位雜交

收集野生型C57BL/6J雌性小鼠P1、P3、P5的卵巢，通過4%多聚甲醛(PFA)固定、石蠟包埋.組織切成12 μm厚度，經(jīng)4%PFA固定、蛋白酶K處理、乙酸酐處理后，雜交液室溫封閉1 h，加入地高辛標(biāo)記的RNA探針在65 ℃條件下孵育過夜.寡核苷酸引物根據(jù)小鼠cDNA通過PRIMER3軟件設(shè)計(jì)：Riok3For: 5’-ACCCCTCAAAACACAGTATCC；Riok3Rev: 5’-GTTCCTTCTTCTCGTGTAGACG.次日，樣品分別經(jīng)SSC、Tris-HCl緩沖液浸洗，加入偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗地高辛的抗體經(jīng)4 ℃孵育過夜后再次用Tris-HCl緩沖液浸洗，最后加入底物BM Purple(Roche，11442074001)顯色，在PBS緩沖液中終止反應(yīng)，加伊紅對染，中性樹脂封片、拍照.

1.2.2 免疫組化

收集野生型C57BL/6J雌性小鼠P1、P3、P5的卵巢，通過4%PFA固定、石蠟包埋.組織切成5 μm厚度，經(jīng)脫蠟水化、高壓抗原修復(fù)、H2O2處理、0.1%PBS-Triton X-100清洗、5%BSA室溫封閉后加入一抗Riok3單克隆抗體(proteintech，13593-1-AP)，4 ℃孵育過夜.次日加入二抗，經(jīng)DAB 顯色(VECTOR，SK-4100)、快紅對染后中性樹脂封片、拍照.

1.2.3 基因打靶載體的構(gòu)建

以基因打靶的干細(xì)胞基因組DNA為模板，在Riok3基因起始密碼子上游擴(kuò)增4 kb作為同源重組的長臂(5’arm)，在起始密碼子下游擴(kuò)增2.5 kb作為同源重組的短臂(3’arm)，分別進(jìn)行TA克隆.然后通過酶切、連接的方法將兩個片段整合到含有Neo(指新霉素抗性基因，選擇性篩選的陽性標(biāo)記)和DTA(指白喉毒素A亞基的負(fù)性篩選標(biāo)記)篩選基因的打靶載體內(nèi)，其中LoxP-LoxP-Neo(LoxP指Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)中在外顯子兩側(cè)的序列)位于兩個重組臂的中間.構(gòu)建成功的載體進(jìn)行測序，測序正確后用Qiagen的無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提.

1.2.4 胚胎干細(xì)胞基因打靶

用限制性內(nèi)切酶Pac Ⅰ(NEB，#R0547L)將300 μg基因打靶載體線性化，經(jīng)過酚-氯仿純化后用于胚胎干細(xì)胞基因打靶.復(fù)蘇MEF和NeoR MEF細(xì)胞，用絲裂霉素C處理的MEF細(xì)胞作為基因打靶ES細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞，在ES細(xì)胞生長至指數(shù)生長期時用于基因打靶實(shí)驗(yàn).將收集的ES細(xì)胞與線性化的打靶載體DNA混合、靜置，轉(zhuǎn)移至電擊杯中，用伯樂電擊儀電擊，冰上靜止后，鋪到含有NeoR MEF的培養(yǎng)皿中，從第2天開始，細(xì)胞每天換含有G418(Sigma，A1720-5G)的新鮮培養(yǎng)基.G418篩選的第8天，挑單克隆.在解剖鏡下選取飽滿的、邊緣清晰的細(xì)胞集落，挑至96孔板中.

1.2.5 胚胎干細(xì)胞陽性克隆篩選

將96孔板胚胎干細(xì)胞單克隆用堿裂解法提取基因組DNA，并用乙醇沉淀，以得到的基因組DNA為模板，用PCR的方法進(jìn)行胚胎干細(xì)胞陽性克隆篩選.為鑒定5’arm 是否重組，將正向引物設(shè)計(jì)在基因組上5’arm 上游200 bp 以外，反向引物設(shè)計(jì)在基因打靶載體5’arm 的下游；為鑒定3’arm 是否重組，正向引物設(shè)計(jì)在打靶載體3’arm 的上游，反向引物設(shè)計(jì)在基因組上3’arm 下游200 bp以外.只有當(dāng)兩個PCR條帶大小都正確，才可以確定這些克隆發(fā)生了同源重組，作為陽性克隆.

1.2.6 基因打靶小鼠模型的構(gòu)建

1.2.6.1 超數(shù)排卵

向供體雌鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)10 IU，46～48 h后再注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5 IU.隨后將其與雄鼠合籠過夜，次日清晨7：00檢查陰栓(見栓后標(biāo)記為E0.5).

1.2.6.2 囊胚的獲取

小鼠見栓后第3天(E3.5)，用1 mL注射器抽取沖卵液，將針頭插入輸卵管子宮體結(jié)合處，將子宮置于培養(yǎng)皿中并進(jìn)行沖洗.將沖出的液體在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察，用移卵針撿出發(fā)育階段和質(zhì)量較好的胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一般選用桑葚胚到囊胚期的胚胎.

1.2.6.3 顯微注射

用嘴控移卵管轉(zhuǎn)移胚胎至顯微鏡臺上的注射操作室，固定住囊胚，將具有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)的胚胎放在6點(diǎn)或12點(diǎn)位置，瞄準(zhǔn)后注射針快速準(zhǔn)確地穿過透明帶，慢慢地釋放ES細(xì)胞進(jìn)入囊胚腔，再慢慢抽出注射針.定期把注射過的胚胎轉(zhuǎn)移到二氧化碳培養(yǎng)箱里，于M16培養(yǎng)基中培養(yǎng).

1.2.6.4 胚胎移植

麻醉受體假孕母鼠，暴露受體雌鼠子宮，將注射ES細(xì)胞的胚胎吸入移卵針，在輸卵管子宮結(jié)合部幾毫米處避開血管開孔，將囊胚吹入子宮.術(shù)后將小鼠放置于干凈的鼠籠里，用50 W的燈泡保溫，并放在保溫臺上，直到其蘇醒.

1.2.7 嵌合體小鼠的判定與交配

胚胎移植后21 d左右小鼠產(chǎn)仔，10 d左右可根據(jù)毛色顯性判斷其是否為嵌合體(chimera)以及嵌合率情況.將雄性嵌合體小鼠與C57BL/6J野生型小鼠交配，后代通過基因型鑒定，含有目的基因片段的雜合子小鼠為構(gòu)建成功的Riok3條件基因打靶小鼠F1代.

2 結(jié)果及分析

2.1 原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測Riok3在小鼠卵巢中的表達(dá)

通過Riok3mRNA基因編碼序列的原位雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在P1、P3和P5小鼠的卵母細(xì)胞中Riok3均有特異性的表達(dá)(圖2).故推測Riok3基因可能參與小鼠卵泡的發(fā)育過程，進(jìn)而參與卵巢發(fā)育.

注:箭頭表示卵母細(xì)胞.圖2 原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測Riok3在小鼠卵巢中的表達(dá)Fig.2 Detection of Riok3 expression in mouse ovary by in situ hybridization注:箭頭表示卵母細(xì)胞.圖3 免疫組化檢測Riok3在小鼠卵巢中的表達(dá)Fig.3 Immunohistochemical assay of Riok3 expression in mouse ovary

2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測Riok3在小鼠卵巢中的表達(dá)

對P1、P3和P5的小鼠卵巢進(jìn)行Riok3抗體的免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Riok3在出生后小鼠第1、第3和第5天的卵巢卵母細(xì)胞中都有明顯信號(圖3)，表明Riok3參與卵泡的發(fā)育過程，進(jìn)而參與卵巢發(fā)育.

2.3 Riok3基因打靶的載體構(gòu)建及基因打靶

將成功構(gòu)建的Riok3條件基因打靶質(zhì)粒線性化后，經(jīng)胚胎干細(xì)胞的基因打靶，利用PCR方法篩選陽性重組克隆.3’同源臂鑒定PCR長度為3.9 kb，5’同源臂鑒定的長度為5 kb，打靶載體構(gòu)建如圖4所示.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，E號克隆為陽性克隆(圖5).

注：E1—E6表示外顯子1—6.

a b

2.4 Riok3基因打靶小鼠模型構(gòu)建

圖6 顯微注射原理圖

將得到的陽性干細(xì)胞進(jìn)行囊胚顯微注射、胚胎移植，得到嵌合體小鼠(圖6).本研究經(jīng)胚胎移植的代孕母鼠共4只，最終得到3窩存活的嵌合體小鼠共12只.根據(jù)毛色挑選嵌合率較高的雄性嵌合體小鼠4只與C57BL/6J雌鼠進(jìn)行交配，得到F1代小鼠.收取其尾部組織，經(jīng)過堿裂解法提取基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型鑒定.陽性條帶大小為246 bp，野生型條帶大小為147 bp.Riok33 LoxP鑒定For1：AGCTTTAGCGTCTGACTGG；Riok33 LoxP鑒定Rev1：TGAGTGCTTTTTTGAGTGTCC.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2、3、6、7、8、9、10、13和16號為雜合子小鼠，其余均為野生型小鼠(圖7).

1～17：F1代小鼠代號；M：電泳marker.

3 討論

蛋白激酶在體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著重要的角色，其中Riok3被發(fā)現(xiàn)在真核生物中參與細(xì)胞周期過程中核糖體的生物合成[12,16].Riok3mRNA基因編碼序列的原位雜交實(shí)驗(yàn)和Riok3抗體的免疫組化實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)Riok3在P1、P3和P5小鼠卵巢卵母細(xì)胞中高表達(dá)，表明Riok3可能參與小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育過程.為此，本研究構(gòu)建了Riok3條件基因打靶載體，通過基因打靶、干細(xì)胞囊胚注射和胚胎移植，得到了Riok3條件基因打靶的嵌合體小鼠.至此，成功構(gòu)建Riok3條件基因打靶的小鼠模型(Riok3loxP/loxP).

接下來可將Riok3loxP/loxP基因型小鼠與在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)的GDF9-Cre基因型小鼠雜交，以獲得卵母細(xì)胞中特異性敲除Riok3的突變型小鼠(Riok3loxP/loxP/GDF9-Cre)，進(jìn)一步研究Riok3在卵母細(xì)胞發(fā)育中的功能，深入了解Riok3在卵巢發(fā)育過程中的分子調(diào)控機(jī)制.