王斯 ,劉茂東 ,遲雁青 ,康英麗 ,李英
(1.杭州市中醫(yī)院,浙江 杭州 310007;2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院,河北 石家莊 050017)
氧化應激與腎臟疾病的發(fā)病關系密切,其參與海曼腎炎(IMN動物模型)[1-2]、糖尿病腎病及慢性腎衰竭等[3-4]發(fā)病過程。錳超氧化物歧化酶(SOD2)屬于金屬酶類,是抗氧化細胞保護系統(tǒng)的主要組成部分,可將毒性的超氧化物陰離子(02-)轉(zhuǎn)化為過氧化氫和雙原子氧,在機體氧化與抗氧化平衡中起重要的作用,與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分[5-6]。近年來,特發(fā)性膜性腎?。↖MN)的發(fā)病率逐年上升,但具體發(fā)病機制未知,目前認為與IMN產(chǎn)生的特異IgG4足細胞自身抗體和抗原結(jié)合形成上皮下免疫復合物、激活補體系統(tǒng)后導致足細胞損傷和凋亡、產(chǎn)生大量蛋白尿有關。國外學者Prunotto等[7]用結(jié)合蛋白組學法測定人類IMN患者血清和腎小球中的抗足細胞膜蛋白抗體,在患者血清中發(fā)現(xiàn)了SOD2和IgG4抗體,免疫熒光檢測到SOD2及IgG4共同沉積在腎小球中。本文主要探討SOD2在IMN患者腎組織中的表達及其與IgG4表達部位的關系,為SOD2在IMN發(fā)病中的作用提供依據(jù)。
1.1 一般資料 收集2013年6-12月河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院經(jīng)腎活檢確診的IMN住院患者,并選擇同期繼發(fā)性膜性腎?。⊿MN)、微小病變性腎?。∕CD)住院患者作為對照。納入標準:(1)臨床及腎活檢病理檢查均符合 IMN、SMN、MCD的診斷,SMN患者臨床上須有繼發(fā)因素,腎活檢病理符合不典型膜性腎疾病理表現(xiàn);(2)既往未接受過激素、免疫抑制劑或腎移植治療。排除標準:合并其他腎臟、心臟、肝臟疾病及糖尿病等系統(tǒng)性疾病。IMN組41 例,男 19 例,女 22 例,年齡(5.8±13.0)歲;SMN組 13 例,男6 例,女 7 例,年齡(8.6±14.2)歲;MCD組 6 例,男 4 例,女 2 例,年齡(2.8±14.8)歲。三組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過且患者知情同意。
1.2 方法 收集患者性別、年齡、24小時尿蛋白定量、血肌酐等資料。免疫組化法檢測患者腎組織SOD2及IgG4的表達:腎組織蠟塊切片后脫臘并進行抗原修復,后將切片放入3% H2O2溶液中清除內(nèi)源性過氧化物酶,滴加一抗,滴加二抗孵育,DAB顯色,蘇木素復染細胞核,經(jīng)分化、返藍、脫水、透明后封片。顯微鏡隨機選取10個視野,用Image-ProPlus 6.0軟件進行半定量分析。
1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用(±s)表示,正態(tài)分布資料多組間比較采用方差分析;計數(shù)資料用百分率表示,并采用χ2檢驗;相關性檢驗采用線性相關分析。
2.1 SOD2和IgG4的表達 (1)SOD2在各組的腎小管上皮細胞中均有表達,且表達無明顯差異;SOD2在IMN組腎小球中有一定表達,在SMN組和MCD組腎小球中僅微量表達(圖1A-1C)。腎小球基底膜、上皮下SOD2的表達IMN組較SMN組、MCD組均顯著增強,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),SMN組與MCD 組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(2)IgG4 在IMN組腎小球基底膜、上皮下均有表達,而在SMN組、MCD組腎小球基底膜中未見表達(圖1D-1F)。IMN組與SMN組、MCD組比較,腎小球內(nèi)IgG4表達增強,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);SMN 組與 MCD組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。
表1 三組SOD2和IgG4在腎小球基底膜、上皮下的表達
2.2 相關性分析 在IMN組中,腎小球內(nèi)SOD2的表達與24小時尿蛋白定量呈顯著負相關 (r=-0.354,P=0.023);IgG4 的表達與 24 小時尿蛋白定量呈正相關(r=0.361,P=0.021);SMN 組、MCD 組腎小球內(nèi)SOD2、IgG4的表達與24小時尿蛋白定量均無相關性(P>0.05)。詳見表 2。
表2 三組SOD2/IgG4與24小時尿蛋白定量的相關性
SOD2是廣泛的抗氧化細胞保護系統(tǒng)的重要組成部分,存在于人體細胞線粒體基質(zhì)內(nèi)[8-9],可將毒性的超氧化物離子(02-)轉(zhuǎn)化為過氧化氫和雙原子氧,對抗并阻斷氧自由基對細胞造成的損害,并及時修復受損細胞,在清除自由基、維持線粒體及機體氧化應激平衡中具有重要作用。在腎臟中,SOD2廣泛表達于腎小管上皮細胞[10],特別是皮質(zhì),而在腎小球中的表達則少見報道[7],SOD2在腎臟表達的升高與腎臟的毒性損傷密切相關。
本研究發(fā)現(xiàn),SOD2在各組腎小管上皮細胞中均有表達,且表達無明顯差異,這與文獻報道基本一致[7]。同時,SOD2在IMN腎小球基底膜、上皮下表達水平較高,在SMN組、MCD組僅微量表達,且SOD2在IMN中的表達水平與24小時尿蛋白定量呈負相關,在SMN組、MCD組中未發(fā)現(xiàn)存在相關性,提示SOD2可能是IMN腎小球特異性表達的物質(zhì),推測IMN發(fā)病過程中可能存在腎臟的氧化損傷,導致足細胞受損,大量SOD2從線粒體中釋放,發(fā)揮抗氧化功能,修復受損細胞,降低尿蛋白的產(chǎn)生,對腎臟起到積極的保護作用,同時在氧化與抗氧化過程中發(fā)揮重要作用。
Mubarak等[11-13]檢測了IMN患者腎臟中抗足細胞抗體的種類及含量,發(fā)現(xiàn)IgG4是所有抗體中最常見的亞型,抗體滴度IMN比健康人和病理對照組均高,腎活檢組織中可觀察到IgG4和C3呈顆粒狀沉積在腎小球基底膜,電鏡可見免疫復合物沉積在腎小球基底膜上皮下。本研究結(jié)果顯示,IgG4在大部分IMN患者腎小球基底膜上皮下均有表達,較SMN、MCD表達顯著增強,與文獻報道一致。且IMN組IgG4的表達水平與24小時尿蛋白定量呈正相關,在SMN組、MCD組中未發(fā)現(xiàn)存在相關性。由此證實IgG4為IMN的主要致病抗體,與蛋白尿的形成密切相關。
圖1 三組腎組織中SOD2和IgG4的表達。1A-1C:SOD2在IMN、SMN、MCD中的表達,紅色箭頭標注的為SOD2在腎小管上皮細胞的表達(棕色著色區(qū)),綠色箭頭標注的為SOD2在腎小球基底膜、上皮下的表達(棕色著色區(qū));1D-1F:IgG4在IMN、SMN、MCD中的表達,藍色箭頭標注為IgG4在腎小球基底膜、上皮下的表達 (棕色著色區(qū))。 (En Vision×200)
有國外學者在IMN患者血清中檢測到特定的抗SOD2 IgG4抗體,其將IMN腎小球微切割后也洗脫出高滴度的抗SOD2 IgG4抗體,推測SOD2在腎組織中的表達及抗體的形成可能與IMN的發(fā)病過程有關[7]。本研究觀察到SOD2與IgG4在IMN腎小球中的表達部位基本一致,均沉積在腎小球基底膜及上皮下,由此推測,SOD2不僅在氧化應激時對腎組織具有保護作用,當氧化應激過度時,SOD2也可能作為一種足細胞致病抗原,與IgG4形成免疫復合物,沉積在腎臟,激活補體系統(tǒng)后形成膜攻擊復合物致足細胞損傷,參與IMN的發(fā)病過程。
綜上所述,SOD2在IMN腎小球基底膜、上皮下表達增高,且與24小時尿蛋白定量呈負相關,提示SOD2在IMN腎臟氧化物應激時對機體起保護作用,降低尿蛋白的產(chǎn)生;SOD2與IgG4均在IMN腎小球基底膜上皮下沉積,推測SOD2也可能作為足細胞致病抗原參與IMN的發(fā)病過程。