張 迪 李曉蘭

(三峽大學(xué) 第二人民醫(yī)院[宜昌市第二人民醫(yī)院] 婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443003)

近些年，隨著宮頸癌篩查的普及，發(fā)病率呈明顯上升且年輕化的趨勢(shì)，宮頸癌已成為女性生殖道最常見(jiàn)的惡性腫瘤。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma viral,HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因。目前，有研究認(rèn)為單純的HPV感染不足以引起宮頸癌的發(fā)生，只有HPV-DNA與宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)染色體發(fā)生整合才可能引起宿主細(xì)胞基因突變導(dǎo)致宮頸癌[1]。HPV-DNA在宿主細(xì)胞染色體上的整合是HPV持續(xù)感染的關(guān)鍵步驟，是宮頸病變進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志[2]。

1 HPV的結(jié)構(gòu)與功能

HPV是一種常見(jiàn)的嗜黏膜、皮膚的環(huán)狀雙鏈DNA乳頭狀病毒，由病毒蛋白外殼和核心DNA構(gòu)成，無(wú)包膜，以共價(jià)閉合的超螺旋結(jié)構(gòu)、開(kāi)放的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、線性分子3種形式存在于細(xì)胞內(nèi)。HPV-DNA可分為3個(gè)功能區(qū)，即早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(early region,E區(qū))、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(late region，L區(qū))和位于兩段序列之間的非編碼區(qū)-病毒上游調(diào)節(jié)區(qū)(upstream regulate region,URR區(qū))，URR區(qū)也稱(chēng)長(zhǎng)控制區(qū)域(long control region,LCR)。E區(qū)主要編碼E1、E2、E4、E5、E6、E7、E8等7個(gè)早期蛋白，參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等活動(dòng)[2]。其中，E1參與病毒DNA的復(fù)制和復(fù)制抑制；E2鉸鏈區(qū)可激活、抑制病毒轉(zhuǎn)錄，反式調(diào)節(jié)病毒mRNA轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制[3]；E1和E2區(qū)為常見(jiàn)病毒整合位點(diǎn)；E4與病毒復(fù)制及突變的發(fā)生密切相關(guān)；E5主要調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞DNA合成；E6、E7區(qū)為多數(shù)HPV亞型的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，協(xié)同參與病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)錄激活，可分別與p53、pRb抑癌基因結(jié)合形成復(fù)合體，使p53、pRb抑癌作用消失，細(xì)胞永生化，與HPV的致癌作用密切相關(guān)[4]；E8蛋白功能目前尚不明確，可能參與病毒復(fù)制。L區(qū)編碼衣殼蛋白L1和次衣殼蛋白L2，對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)起結(jié)構(gòu)性支撐作用。HPV的特殊生物學(xué)結(jié)構(gòu)與功能在其感染或持續(xù)感染細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。

2 HPV的整合位點(diǎn)及相關(guān)基因

1987年，El-Awady首次在SiHa細(xì)胞染色體13q22上KLF5和KLF12的基因間區(qū)中檢測(cè)到HPV16-DNA，并提出HPV-DNA的整合觀點(diǎn)[5]。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，HPV在宮頸上皮細(xì)胞染色體上的整合位置為隨機(jī)產(chǎn)生，E1、E2、E4、E5區(qū)最常見(jiàn)。有研究者收集國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，共發(fā)現(xiàn)400余次HPV整合事件[6-7]。有研究者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR等檢測(cè)方法，在宮頸病變組織中發(fā)現(xiàn)100余個(gè)病毒基因組的整合位點(diǎn)[8-9]。Hu等[10]利用全基因組測(cè)序和雜交捕獲技術(shù)找到3 667個(gè)HPV在宿主細(xì)胞的整合位點(diǎn)，提供了HPV的病毒整合位點(diǎn)分布圖，其中有數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)基因在不同宮頸癌樣本中同時(shí)存在整合位點(diǎn)；還提出高頻整合位點(diǎn)，如POU5F1B、FHIT及KLF12等，并認(rèn)為HPV在宿主細(xì)胞內(nèi)可能呈“非隨機(jī)整合”。這表明，HPV-DNA可能呈多片段基因整合。

病毒整合常發(fā)生于宿主細(xì)胞基因組的內(nèi)含子和編碼基因的密集區(qū)，如脆性位點(diǎn)附近、轉(zhuǎn)錄活性區(qū)、致癌基因等，以脆性位點(diǎn)最常見(jiàn)。脆性位點(diǎn)是人類(lèi)染色體受外界刺激后易發(fā)生斷裂的高度不穩(wěn)定區(qū)，分罕見(jiàn)脆性位點(diǎn)(rare fragile sites,RFSs)和普通脆性位點(diǎn)(common fragile sites,CFSs)。Schmitz等[11]發(fā)現(xiàn)HPV約66%的整合位點(diǎn)位于(34%)或靠近(32%)脆性位點(diǎn)。高危型HPV-DNA主要整合到宿主細(xì)胞的染色體中，除9、18、22染色體外，其他染色體均有整合位點(diǎn)[12]。Pett等[13]認(rèn)為HPV多整合到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)或結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的染色體區(qū)，如8q24、17q23.1、1p36、3q2813q22、14q32等，其中的腫瘤相關(guān)基因及其附近的位點(diǎn)亦具有易斷裂、融合特性。常見(jiàn)的整合基因有FRA3B基因、FRA6C基因、FRA17B基因和c-myc、N-myc、TNF AIP2致癌基因等?；蛘衔稽c(diǎn)與整合基因的確定可為靶向治療提供理論依據(jù)。

3 HPV-DNA整合的可能致癌機(jī)制

HPV的開(kāi)放閱讀框E1和E2區(qū)斷裂整合可引起E1、E2基因損壞或缺失，E1、E2蛋白質(zhì)異常表達(dá)。E2對(duì)E6、E7的轉(zhuǎn)錄抑制作用下降，E6和E7大量表達(dá)并與p53、pRb抑癌基因結(jié)合形成復(fù)合體，導(dǎo)致抑癌作用喪失、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失常，細(xì)胞在G1期停滯進(jìn)入無(wú)限增殖，細(xì)胞永生化，最終發(fā)生癌變[4]。病毒基因整合宿主細(xì)胞染色體發(fā)生的變化，以染色體易位、缺失、重排和非染色體損害等方式為主。染色體突變可使致癌基因激活和抑癌基因失活。HPV-DNA整合至宿主細(xì)胞染色體后，MYC和HMGA2等致癌基因過(guò)度表達(dá)，F(xiàn)HIT和LRP1B等抑癌基因表達(dá)下調(diào)，宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化[11，14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，EP300(16%)、FBXW7(15%)、PIK3CA(14%)、HLA-B(9%)和p53(9%)的基因突變與宮頸鱗癌發(fā)生有一定相關(guān)性，PIK3CA(16%)、ELF3(13%)、KRAS(8%)和CBFB(8%)的基因突變與宮頸腺癌發(fā)生有一定相關(guān)性[16-18]。Bierkens等[19]研究認(rèn)為PIK3CA基因突變可能增加宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。HPV-DNA的整合與宿主染色體突變有明顯相關(guān)性。

4 HPV-DNA整合狀態(tài)的檢測(cè)方法

HPV-DNA在宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)主要分為三種：游離型、整合型和二者兼有的混合型。研究發(fā)現(xiàn)，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(CIN I)的HPV-DNA呈游離狀態(tài)，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(CIN II-III)及宮頸癌中HPV-DNA多呈整合狀態(tài)，且隨病變程度的加重整合率明顯增加[9]。目前用于檢測(cè)HPV整合的方法有：熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization,FISH)、雜交捕獲法(hybrid capture method,HC)、Southern印跡雜交法、連接-介導(dǎo)-PCR法、多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、多重連接依賴(lài)式探針擴(kuò)增法(multijunction dependent probe amplification,MLPA)及致癌基因轉(zhuǎn)錄子擴(kuò)增法(amplification of papillomavirus oncogene transcript test,APOT)。

4.1 FISH法

FISH技術(shù)是利用探針互補(bǔ)性與被檢標(biāo)本細(xì)胞中核酸序列進(jìn)行雜交，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，根據(jù)有無(wú)熒光信號(hào)及信號(hào)強(qiáng)度，了解HPV-DNA在細(xì)胞內(nèi)的分布情況及定位病毒整合染色體的位置。信號(hào)呈彌散分布為游離型，點(diǎn)樣密集分布為整合型，兩者兼有為混合型[20]。

4.2 HC法

HC是唯一獲得食品及藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的HPV分型檢測(cè)方法。按照高危型DNA的全基因組文庫(kù)設(shè)計(jì)捕獲探針，DNA文庫(kù)與捕獲探針雜交后吸附捕獲，未被捕獲的DNA洗脫，洗脫DNA中如果存在整合位點(diǎn)，再進(jìn)行測(cè)序、擴(kuò)增，獲得病毒整合的染色體圖譜。HC的敏感度高，但設(shè)備要求及檢測(cè)費(fèi)用等較高，難以普及[21]。

4.3 Southern印跡雜交檢測(cè)法

Southern印跡雜交經(jīng)過(guò)酶切電泳圖譜對(duì)酶切條帶狀態(tài)進(jìn)行分析。當(dāng)條帶為環(huán)樣8 kb左右的分子長(zhǎng)度時(shí)，考慮為游離狀態(tài)；當(dāng)大于15 kb時(shí)，考慮為整合狀態(tài)。其敏感度低，檢測(cè)量大，操作較復(fù)雜，不宜大范圍推廣。

4.4 連接-介導(dǎo)-PCR法

連接-介導(dǎo)-PCR技術(shù)能檢測(cè)整合HPV的病毒序列，可應(yīng)用于HPV永生角質(zhì)細(xì)胞的基因組病毒-細(xì)胞連接體及與HPV擴(kuò)增相關(guān)的宮頸癌細(xì)胞系。此法與測(cè)序方法相結(jié)合，可檢測(cè)整合染色體及分析病毒整合特征，是病毒早期整合階段的檢測(cè)方式，其缺點(diǎn)是不能對(duì)整合數(shù)量進(jìn)行定量，不能對(duì)整合DNA的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行檢測(cè)[22]。

4.5 多重實(shí)時(shí)熒光PCR法

多重實(shí)時(shí)熒光PCR法用不同的熒光基因團(tuán)，對(duì)E6以及E2基因探針標(biāo)記，收集不同基因E2/E6的基因拷貝數(shù)量，實(shí)現(xiàn)定量病毒。其原理主要為HPV病毒整合后使E2破壞、缺失，E6/E7過(guò)度表達(dá)，E6/E7與P53及pRb結(jié)合，抑癌作用消失或減弱，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，E2的缺失和宮頸病變程度呈正相關(guān)。多重實(shí)時(shí)熒光PCR法具有高通量和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，且可避免一定的重組樣本誤差，當(dāng)前運(yùn)用較廣泛[23]。

4.6 MLPA法

MLPA法是以雜交、連接、PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，在單一反應(yīng)管內(nèi)對(duì)不同核苷酸靶序列進(jìn)行電泳分離、數(shù)據(jù)收集，監(jiān)測(cè)靶序列拷貝數(shù)量的變化，分析待測(cè)核苷酸的具體定位和定量。此法具有操作簡(jiǎn)單、高通量、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可以用于染色體的缺失與重排檢測(cè)。由于待測(cè)探針為擴(kuò)增對(duì)象，不適用于染色體的易位檢測(cè)與單個(gè)細(xì)胞的核苷酸檢測(cè)[24]。

4.7 APOT法

APOT法是基于mRNA轉(zhuǎn)錄的一種檢測(cè)方法，可識(shí)別由游離型起源的病毒轉(zhuǎn)錄體以及整合型起源的融合轉(zhuǎn)錄體，對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增后分析完成病毒狀態(tài)的鑒定。APOT可對(duì)E6與E7基因病毒整合位點(diǎn)與表達(dá)水平深入研究，敏感度較高。但因APOT法是基于RNA轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行檢測(cè)，故其應(yīng)用范圍相對(duì)狹窄[25]。

5 HPV-DNA整合和宮頸癌發(fā)生的關(guān)系

HPV病毒持續(xù)感染者是發(fā)生高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的高危人群。其原因可能與病毒整合后逃脫機(jī)體細(xì)胞識(shí)別清除、E2負(fù)調(diào)節(jié)蛋白缺失致抑癌作用降低相關(guān)[26]。Leyendecker等[27]研究發(fā)現(xiàn)HPV16-DNA的整合狀態(tài)與宮頸癌臨床分期、病理類(lèi)型、組織學(xué)分化及預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性。Gargiulo等[28]研究結(jié)果表明，高危型HPV多重感染發(fā)展為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)是高危型HPV單一感染的4倍。另有研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV多重感染可增加宮頸上皮內(nèi)瘤變的風(fēng)險(xiǎn)，但與宮頸癌發(fā)生相關(guān)性低，在宮頸癌中更常表現(xiàn)為高危型HPV單一感染而非高危型HPV多重感染[29]。Cheung等[30]在HPV16、18雙重感染的宮頸癌中發(fā)現(xiàn)，HPV-DNA多為混合型，較HPV16或HPV18單一感染的整合率低。細(xì)胞基因整合位點(diǎn)可能存在非隨機(jī)選擇性及熱點(diǎn)傾向性，故存在不同HPV基因?qū)λ拗骷?xì)胞整合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，相較于單一HPV-DNA感染，雙重感染的游離率更高[31]。多重HPV感染可能并不增加宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[32]。

目前，對(duì)宮頸HPV多重感染及多重HPV基因在宿主細(xì)胞中的整合狀態(tài)如何、對(duì)宮頸病變的影響如何，尚無(wú)定論，仍有待進(jìn)一步研究。

6 總結(jié)及展望

高危型HPV感染，多為一過(guò)性感染，當(dāng)HPV-DNA在宿主細(xì)胞染色體中由游離型變?yōu)檎闲蜁r(shí)，HPV不易被機(jī)體清除呈持續(xù)性感染狀態(tài)，極大地增加了宮頸細(xì)胞惡變的風(fēng)險(xiǎn)。HPV多重感染在宮頸上皮細(xì)胞中的整合狀態(tài)及機(jī)制如何，對(duì)宮頸上皮細(xì)胞有何影響尚不明確。HPV-DNA的整合可能是HPV持續(xù)感染的重要前提條件。HPV-DNA整合檢測(cè)有望成為判斷病毒感染是否呈持續(xù)性、預(yù)測(cè)宮頸病變風(fēng)險(xiǎn)度、評(píng)估HPV治療手段是否有效的重要輔助手段。HPV-DNA整合相關(guān)檢測(cè)方法相對(duì)較多，但各有優(yōu)缺點(diǎn)，找到最佳檢測(cè)方法亦是目前亟需解決的問(wèn)題。