王明陽，唐 穎，劉 芳，陳彩霞，石寶生，袁曉艷

(1 遵義醫(yī)科大學 藥學院分析化學教研室，貴州 遵義 563099)

中藥鉤藤為茜草科植物鉤藤[Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.exHavil.]、大葉鉤藤(UncariamacrophyllaWall.)、毛鉤藤(UncariahirsutaHavil.)、華鉤藤[Uncariasinensis(Oliv.)Havil.]及無柄果鉤藤(UncariasessilifructusRoxb.)的干燥帶鉤莖枝[1]。鉤藤又名貓爪藤，以帶鉤的莖枝入藥，對頭痛眩暈、腦血管疾病和神經(jīng)疾病有著很好的治療效果[2]。在中國和日本，被用于清熱、滅風寒、抗癲癇、安撫肝臟，并已有數(shù)千年的歷史[3]。已報道的鉤藤化學成分有100多種，包括生物堿類、黃酮類、三萜類和苷類等[4]。吲哚類生物堿是鉤藤的主要有效成分，其中以鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿為主要藥效成分[5]。然而，研究表明鉤藤藥材中鉤藤堿含量較低[6]，故有效提取鉤藤中總生物堿，從而提高中藥鉤藤的開發(fā)利用率，是目前需要解決的問題。本實驗采用均勻設(shè)計法，以期獲取最優(yōu)的中藥鉤藤總生物堿的提取工藝條件。均勻設(shè)計是通過改進實驗程序來優(yōu)化提取工藝的最有效的實驗設(shè)計[7-8]。該方法是近年來興起的工藝優(yōu)化方法，具有實驗次數(shù)少、均勻分散、方便、迅速、準確的特點，可使實驗點具有更好的代表性[9]。它尤其適用于建模和分析多因素實驗，來闡明單一效應(yīng)和互動效應(yīng)是如何影響基于一系列統(tǒng)計技術(shù)的響應(yīng)[10]。目前，均勻設(shè)計已廣泛應(yīng)用于食品化學、藥學、材料科學等領(lǐng)域[11]。

本研究擬采用超聲提取法對鉤藤藥材進行總生物堿提取，選用U6(64)均勻設(shè)計實驗法，以鉤藤總堿得率為指標，選取乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比、提取溫度為考察因素，優(yōu)選鉤藤總生物堿的提取工藝。同時建立HPLC對鉤藤藥材提取物中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿進行定性定量分析，為提高鉤藤藥材利用率及質(zhì)量控制標準提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；FA2004N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-ⅢG型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)；79CS型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。對照品鉤藤堿(批號 PRF8081601)、異鉤藤堿(批號 PRF8102541)、去氫鉤藤堿(批號 PRF18032803)、異去氫鉤藤堿(批號 PR17062109)均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，購自美國Tedia公司；水為超純水；其余試劑均分析純；實驗用藥材(產(chǎn)自云南)購自遵義芝林大藥房，經(jīng)遵義醫(yī)科大學生藥學教研室張玉金博士鑒定為鉤藤帶鉤莖枝，以中藥粉碎機粉碎后過60目篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 鉤藤總生物堿含量的測定

1.2.1.1 鉤藤總生物堿的提取 精密稱取鉤藤藥材粉末1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加入70%乙醇40 mL，搖勻，浸泡過夜后，超聲提取3次，濾過后合并提取液，減壓濃縮得粗提取物，粗提取物加0.1%鹽酸15 mL溶解，過濾，濾液用二氯甲烷試劑萃取3次，水層用氨水調(diào)節(jié)pH至10，再用二氯甲烷試劑萃取2次，對萃取液進行濃縮后加無水乙醇溶液稀釋，定容至50 mL容量瓶，得總生物堿儲備液。

1.2.1.2 線性關(guān)系的考察 精密稱取鉤藤堿對照品5.0 mg于50 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并定容。精密量取鉤藤堿對照品儲備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別置于容量瓶中，加無水乙醇稀釋至2 mL。本實驗采用鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液-溴甲酚綠法[12]測定鉤藤總生物堿含量。具體操作如下：向5個容量瓶中分別精密加入4 mL pH 3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液與4 mL溴甲酚綠溶液，振搖，靜置30 min，精密加入2 mL二氯甲烷，充分振搖萃取，分取二氯甲烷層，反復萃取5次后合并二氯甲烷層溶液，將萃取液置于10 mL容量瓶定容，加無水硫酸鈉1.0 g脫水0.5 h，濾過，在413 nm處測定吸光度，以鉤藤堿對照品溶液濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.1.3 鉤藤總生物堿含量的測定 精密量取鉤藤總生物堿儲備液1.0 mL，按“2.1.2”項下方法測定鉤藤總生物堿溶液的吸光度(A)，將所得吸光度(A)代入標準曲線計算鉤藤總生物堿含量，進而得到鉤藤總生物堿得率，鉤藤總生物堿得率計算公式如下：

式中：C為計算所得鉤藤總生物堿濃度(g/mL)；V為鉤藤總生物堿提取后定容的體積(mL)；m為稱量的鉤藤藥材質(zhì)量(g)。

1.2.1.4 鉤藤總生物堿提取條件的優(yōu)化 稱取鉤藤藥材粉末約1.0 g，將乙醇體積分數(shù)(A)、超聲時間(B)、液料比(C)、溫度(D)確定為4個考察因素，每個因素設(shè)置6個水平，選用U6(64)計均勻設(shè)計實驗表，以鉤藤總生物堿得率為指標篩選最優(yōu)化提取工藝，每個實驗重復3次。實驗安排見表1。

表1 均勻設(shè)計法四因素六水平表

1.2.2 4種鉤藤生物堿類成分的定量分析

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為InertsilTMODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為254 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL。流動相為乙腈-0.1%三乙胺磷酸鹽溶液(pH 7)，采用梯度洗脫(0～30 min，乙腈30%～40%；30～40 min，乙腈40%～95%；40～50 min，乙腈95%；50～51 min，乙腈95%～30%C；51～81 min，乙腈30%)。

1.2.2.2 4種生物堿標準曲線的繪制 精密稱取鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿對照品各5.0 mg，分別置于4個5 mL的容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，即得各鉤藤堿化合物對照品溶液。精密量取4種對照品溶液各1.0 mL，共同置于5 mL的容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度約為0.2 mg/mL的混合對照品液。取上述混合對照品溶液2.5 mL，依次稀釋2倍，記作混標2、混標3、混標4、混標5，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣10 μL。以質(zhì)量濃度(X)對峰面積積分值(Y)進行回歸處理，得到鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的標準曲線。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取鉤藤粉末10.0 g，置于500 mL量瓶中，按篩選出的最優(yōu)化提取條件，提取3次，抽濾，合并3次濾液，得供試品溶液。

1.2.2.4 樣品的含量測定 按照最優(yōu)制備工藝提取鉤藤總生物堿，再按“2.2.1”的色譜條件進樣測定。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 精密度實驗 鉤藤總生物堿含量測定過程中，精密吸取同一鉤藤堿對照品儲備液1 mL，按“2.1.2”項下鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液-溴甲酚綠法顯色并測定吸光度，重復測定6次，計算吸光度的RSD值。對于鉤藤生物堿類成分的HPLC定量分析實驗，吸取鉤藤混合對照品溶液10 μL，連續(xù)重復進樣測定6次，測定鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的峰面積，計算各峰面積的RSD值。

1.2.3.2 穩(wěn)定性實驗 鉤藤總生物堿含量測定實驗中，精密量取同一鉤藤堿對照品儲備液1 mL，按“2.1.2”項下鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液-溴甲酚綠法顯色，于室溫放置0、0.25、0.5、0.75、1、1.5 h，測定各時間點的吸光度，計算吸光度的RSD值。HPLC法測定生物堿含量過程中，精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、6、8、16 h 進樣10 μL，記錄鉤藤中各峰面積，計算峰面積的RSD值。

1.2.3.3 重復性實驗 鉤藤總生物堿含量測定實驗中，精密稱取同一批鉤藤藥材粉末6份，按篩選出的最優(yōu)化提取工藝提取鉤藤總堿，并按“2.1.3”項下方法計算鉤藤總堿得率，計算總堿得率的RSD值。HPLC測定生物堿含量實驗中，取同一批次的供試樣品6份，精密稱定， 按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，依法測定，計算各峰面積的RSD值。

1.2.3.4 加樣回收率實驗 鉤藤總生物堿含量測定實驗中，精密量取總生物堿儲備液1.95、1.9、1.8 mL置于3個容量瓶中，分別加入鉤藤堿對照品儲備液0.05、0.1、0.2 mL，按“2.3.1.1”項下鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液-溴甲酚綠法顯色并測定吸光度，計算平均回收率和RSD值。鉤藤中4種生物堿HPLC測定含量實驗中，精密稱定同一批次的已知含量的鉤藤藥材粉末約1.0 g，6份，分別加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算平均加樣回收率。

2 結(jié)果

2.1 鉤藤總生物堿含量的測定

2.1.1 總生物堿標準曲線的繪制 以鉤藤堿濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：A=0.0203C+0.061 8，r=0.993 7，表明鉤藤堿在0.036 7～0.081 9 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2均勻設(shè)計法優(yōu)化鉤藤總生物堿的提取工藝 U6(64)均勻設(shè)計法提取鉤藤總生物堿，通過計算表2得出結(jié)果y=1.260-0.012A-0.00012D2+0.000019AB，由此可以得到乙醇體積分數(shù)A、超聲時間B及提取溫度D對總生物堿含量影響最大，而液料比C對總生物堿含量影響較小。將A、B、D三個因素對鉤藤總生物堿含量進行曲面響應(yīng)分析，見圖1。由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)不變時，總生物堿的提取率隨著超聲時間的增加而逐漸升高，在超聲60 min時達到最大，說明超聲時間越長提取率越高；當超聲時間不變時，總生物堿的提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而逐漸降低，在乙醇體積分數(shù)40%時達到最大，說明乙醇體積分數(shù)越大越不利于總生物堿的提取；同理，當乙醇體積分數(shù)不變時，總生物堿的提取率隨著提取溫度的降低，逐漸升高，當提取溫度為30℃時，總生物堿的提取率達到最高，隨后逐漸降低，可能是由于高溫下總生物堿不穩(wěn)定，使其部分分解，從而導致提取率逐漸降低。故鉤藤總生物堿最佳提取條件為：提取時間為1 h，乙醇體積分數(shù)為40%，溫度為30 ℃，液料比為25∶1。在最佳提取條件下進行提取，總生物堿含量為0.40%。

表2 均勻設(shè)計法結(jié)果

圖1 提取條件響應(yīng)面圖

2.2 4種鉤藤生物堿類成分的定量分析

2.2.1 4種鉤藤生物堿線性關(guān)系的考察 鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿所得回歸方程及線性范圍見表3，其分別在0.003 4～0.051 2 mg/mL、0.003 4～0.050 1 mg/mL、0.003 1～0.049 8 mg/mL、0.002 9～0.051 1 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表3 回歸方程與線性范圍

2.2.2 4種鉤藤生物堿類成分的HPLC含量測定 4種生物堿混合對照品溶液及鉤藤供試品溶液的色譜圖見圖2。此條件下，色譜圖基線平穩(wěn)，鉤藤中4種化學成分分離度良好，與相鄰峰的分離度均>1.5。對均勻設(shè)計法中鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿含量進行測定，結(jié)果見表2，最優(yōu)化提取條件下鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的含量得0.0671%、0.0351%、0.1054%、0.1280%。最優(yōu)化條件下，總生物堿含量最高，鉤藤中四種生物堿的總含量0.34%，占總鉤藤堿含量的85%。

1：異去氫鉤藤堿；2：去氫鉤藤堿；3：異鉤藤堿；4：鉤藤堿。圖2 混合對照品(A)和鉤藤供試品(B)HPLC圖譜

2.3 方法學驗證

2.3.1 精密度實驗 在鉤藤總生物堿的含量測定實驗中，吸光度的RSD值為0.37%(n=6)，表明儀器的精密度良好。同時，HPLC測定鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿實驗中，峰面積的RSD值都在2.33%～2.79%(n=6)范圍內(nèi)，同樣表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 在鉤藤總生物堿含量測定實驗中，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5 h時所測得吸光度的RSD值為0.26%(n=6)，表明鉤藤堿對照品儲備液室溫放置1.5 h穩(wěn)定。同時，以HPLC于室溫0、2，4 ，6，8，16 h時所測得四種鉤藤生物堿峰面積的RSD值在2.61%～3.00%(n=6)范圍內(nèi)，表明處理后的供試品溶液室溫放置16 h穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 按篩選出的最優(yōu)化提取工藝分別對6份鉤藤進行提取，鉤藤總生物堿得率的RSD值為0.28%(n=6)，表明該方法的重復性良好。6份鉤藤提取物中四種生物堿的RSD值在1.07%～1.85%(n=6)范圍內(nèi)，表明該方法重復性好。

2.3.4 加樣回收率實驗 在鉤藤總生物堿含量測定的加樣回收率實驗中，平均回收率為88.2%，RSD值為0.15%，表明該方法的回收率良好。鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的平均加樣回收率分別為88.7%、89.1%、90.2%、91.5%，表明回收率良好。

3 討論

與其他統(tǒng)計方法相比，均勻設(shè)計法不僅減少了多維優(yōu)化中的實驗次數(shù)，而且能夠使每個影響因素達到可能的影響極限[13]。均勻設(shè)計法是一種重要的統(tǒng)計方法，在許多優(yōu)化過程中得到了成功應(yīng)用[14]。因此本實驗采用均勻設(shè)計法對鉤藤總生物堿的超聲提取工藝進行優(yōu)化，通過影響鉤藤中鉤藤總生物堿得率的乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比、提取溫度進行響應(yīng)面實驗，最終得到鉤藤總生物堿最優(yōu)化提取條件為：乙醇體積分數(shù)40%，提取時間1 h，液料比25：1，溫度30℃。在該條件下對芝林大藥房購買鉤藤進行提取，得總生物堿得率為0.40%。均勻設(shè)計法減少了時間，節(jié)約了資源，為鉤藤總生物堿的進一步開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。

高效液相色譜條件盡可能將干擾物質(zhì)與待測物分離開，流動相乙腈-0.1%三乙胺(磷酸鹽調(diào)節(jié)pH 7)，進行梯度洗脫，峰形尖銳，分離度良好。在該色譜條件下，得鉤藤中四種生物堿總含量為0.34%，占總生物堿含量的85%。本研究建立高效液相色譜法，測定中藥鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿含量，方法簡單，且具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復性，為中藥鉤藤質(zhì)量控制提供重要參考。