吉楊松，饒 澄，龍依琳，謝天宏，王世飛

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，貴州 遵義 563099)

耳聾是常見疾病，發(fā)病機制多與聽覺皮層神經(jīng)有關[1]，聽覺皮層神經(jīng)不僅可以接收聽覺刺激，也可以處理早期的多感覺會聚，獼猴聽覺皮層神經(jīng)元對皮膚刺激也可產(chǎn)生反應，提示聽覺皮層神經(jīng)元受損引起的耳聾機制可能更為復雜。細胞凋亡尤其是神經(jīng)元細胞的凋亡往往是不可逆的，聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡一旦發(fā)生，引起持續(xù)性的聽力下降，最終導致耳聾。給患者及其家屬帶來極大痛苦，也給社會帶來較大的經(jīng)濟負擔。增齡性聾(Age-related hearing loss,AHL)是指隨著年齡的增長而出現(xiàn)的雙耳對稱、緩慢進行性的感音神經(jīng)性聽力減退[2]。隨著我國人口老齡化的加劇，AHL的發(fā)病率呈逐年急劇增漲趨勢，需予以高度重視，AHL的致病因素復雜，國內(nèi)外近年來研究提示氧化應激、線粒體突變、細胞凋亡、炎癥等多種途徑都參與了AHL的發(fā)生發(fā)展，并且各種途徑相互影響。因此，進一步明確AHL機制對老年性耳聾的進行預防、早期診斷、個性化治療及聽力言語康復具有重要意義。

本研究觀察敲除了miRNA-34a或SIRT6基因的老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡的差別以及對其聽覺皮層神經(jīng)元中B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關的x蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Cysteine aspartic protease8，Caspase8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartic protease3，Caspase3)表達的影響，以期探討miRNA-34a、SIRT6對老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡的作用機制及相互關系。

1 材料與方法

1.1 動物 miRNA-34a基因敲除小鼠10只，SIRT6基因敲除小鼠10只，野生型小鼠10只，上述小鼠來源于實驗動物均由南京大學模式動物研究所提供，按要求飼養(yǎng)于本單位實驗動物中心，喂養(yǎng)至16月齡并成活。獲遵義醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 藥品及試劑 Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、Caspase8單克隆抗體、Caspase3單克隆抗體均購于武漢博士德生物有限公司。轉移緩沖液、細胞裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒均購自美國R&D systems公司。

1.3 器材 -80 ℃冰箱(中科美菱，DW-HL388)；電子天平(民橋，F(xiàn)A-N)；超凈工作臺(北京亞泰隆，YT-CJ-2NB)；臺式冷凍離心機(湘儀，TGL-16)；熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51)；恒溫水浴箱(J-MAX，HH-2)；搖床(其林貝爾，TS-92)；顯微鏡(奧林巴斯，CX41-72C02)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 miRNA-34a基因敲除小鼠為miRNA-34a敲除組，SIRT6基因敲除小鼠為SIRT6敲除組，野生型小鼠為對照組，每組均為10只動物。

1.4.2 取材 喂養(yǎng)達16月齡后，腹腔注射0.1%戊巴比妥充分麻醉，斷頭后，從枕骨大孔處進入，用止血鉗將顱骨一片一片剝離，剝開頭頂上的顱骨后，就可用玻璃分針將整個腦組織輕輕掏出。取出后在冰上分離皮層,按小鼠大腦功能定位分區(qū)選擇A1區(qū)(聽覺皮層)。立即取出小鼠雙側聽覺皮層放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片，留待作TUNEL檢測及免疫組化檢測。

1.4.3 TUNEL法檢測各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡 TUNEL染色后，在顯微鏡下觀察各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡情況，計算凋亡指數(shù)。

1.4.4 免疫組化檢測各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡相關基因表達情況 將石蠟切片脫蠟后，在磷酸鹽緩沖液中沖洗3次，每次5分鐘，室溫孵育10 min后以蒸餾水沖洗3次，滴加Bcl-2、Bax、Caspase8、Caspase3單克隆抗體，室溫孵育2 h，以磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2 min，滴加一抗后室溫孵育1 h，再以磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次2分鐘，滴加二抗后室溫孵育30 min，顯色劑顯色，自來水充分沖洗，復染，封片。在高倍顯微鏡下隨機選擇5個視野用于圖像分析，以平均積分光密度表示其表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)結果 miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)與SIRT6敲除組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，miRNA-34a敲除組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SIRT6敲除組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)。

*：與SIRT6敲除組相比，P<0.05。圖1 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)

2.2 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡相關基因表達結果 miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元抑凋亡基因Bcl-2表達量與SIRT6敲除組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，miRNA-34a敲除組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SIRT6敲除組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元促凋亡基因Bax、Caspase8、Caspase3表達量與SIRT6組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，miRNA-34a敲除組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SIRT6敲除組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2)。

*：與SIRT6敲除組相比，P<0.05。圖2 各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡因子表達比較

2.3 miRNA-34a與SIRT6相關性結果 對miRNA-34a敲除組與SIRT6敲除組老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)行相關性分析，兩組呈負相關(r=0.629，P<0.05)。

3 討論

聽覺皮層神經(jīng)還可會聚動物的選擇和預期的報酬大小，對聲音的獎勵期望和選擇相關活動的影響主要在聽覺皮層的紋狀體后尾中[3]，將特定選擇的信息與整個聽覺皮質(zhì)層神經(jīng)元途徑的獎勵信號相結合，可能有助于聲音驅動行為的適應[4]。電生理研究表明，聽覺皮層神經(jīng)元還可編碼聲音刺激的時間結構，選擇性的關注一種聲音而忽略其他聲音刺激[5]，本研究未能對miRNA-34a與SIRT6基因敲除老齡小鼠進行各種聲音刺激，因此無法確定小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞不同凋亡情況與不同聲音刺激的相關性，今后的研究的中如能進行相關研究，則有助于了解聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡與神經(jīng)元對聲音刺激的定量改變，有利于聽覺皮層神經(jīng)元的保護研究。

增齡性聾(Age-related hearing loss,AHL)是指隨著年齡的增長而出現(xiàn)的雙耳對稱、緩慢進行性的感音神經(jīng)性聽力減退。隨著我國人口老齡化的加劇，AHL的發(fā)病率呈逐年急劇增漲趨勢，需予以高度重視，AHL的致病因素復雜，國內(nèi)外近年來研究提示氧化應激、線粒體突變、細胞凋亡等多種途徑都參與了AHL的發(fā)生發(fā)展，并且各種途徑相互影響。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育在不同的發(fā)育時期神經(jīng)炎癥相關因子子存在差異[6]，因此炎癥也在參與了AHL的進程。

MicroRNA(miRNA)是一組內(nèi)源性非編碼RNA(長度為22nt)，可通過與特定mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)完全或部分互補來誘導靶基因沉默，以序列特異性方式參與轉錄后基因表達調(diào)控，是重要的基因調(diào)節(jié)劑，參與到多種細胞過程[7]。miRNA-34a是一種較為保守的miRNA，通常作為癌癥的生物標記物，其介導癌癥細胞多與細胞增殖、細胞凋亡等相關。miRNA-34a在腦組織中主要通過介導細胞凋亡因子干預細胞生物過程，對miRNA的生理學和與疾病相關的機制的更多了解可能有助于開發(fā)診斷和治療各種疾病的新策略。miRNA有望成為神經(jīng)退行性疾病早期診治及病情評估的新思路和新方法[8]。

SIRT6是Sirtuin NAD+依賴性酶家族的成員，既往對長壽基因SIRT1研究較深入，SIRT1基因維持細胞染色質(zhì)沉默，保護細胞應對氧化損傷[8]，其活性形式可與抑癌基因 P53 結合，參與 P53 介導的信號傳導[9]，影響多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及機體衰老進程的。目前另一長壽基因SIRT6逐漸被人們重視，因其在染色質(zhì)信號傳導和基因組維持中發(fā)揮重要作用。且SIRT6可以防止與衰老相關的疾病發(fā)生，甚至包括代謝疾病和癌癥。近年來的研究表明，SIRT6是一種復雜的酶，具有多種底物和催化活性，可介導多種細胞凋亡途徑，發(fā)揮抑制細胞凋亡作用[10]。SIRT6是一種營養(yǎng)傳感器和組蛋白脫乙?；福琒IRT6的缺失會導致其下游凋亡基因過度乙?；?，驅動凋亡因子表達[11]。SIRT6的下調(diào)可以模擬miRNA-34a，發(fā)揮促進細胞凋亡作用。

SIRT6能夠對 PARP1、NF-κB 以及Hif-1α這三個轉錄因子在組蛋白上進行去乙?；鸬秸{(diào)控作用，使它們在參與其各自炎癥反應、下游 DNA的損傷修復以及調(diào)控與糖類、脂類等能量代謝相關酶的表達或功能方面表現(xiàn)出有利于機體自身的效應。生物體之所以能在演變過程 中維持基因組結構與功能的相對穩(wěn)定，也許正是通過減少炎癥因子對機體的不良作用，減少DNA 的損傷，以及提高與能量代謝有關酶的正常生理活動，以達到改善能量代謝功能低下與紊亂狀態(tài)，從而顯現(xiàn)出延緩衰老的效應。近年國內(nèi)有學者研究顯示，miR-34a在“老年”的年齡相關性聾模型C57BL/6小鼠聽皮層組織中高表達[12],SIRT6是一個理想的“長壽因子”，如何調(diào)控SIRT6，可能成為未來研究人類抗衰老及老年性疾病的關鍵點。

Bcl-2基因家族成員因含有不同Bcl-2同源結構域而分別發(fā)揮抗凋亡與促凋亡活性，Bcl-2含有完整的4個同源結構域，可發(fā)揮抗凋亡活性，聽覺皮層神經(jīng)元細胞中，Bcl-2是miRNA-34a的直接靶標，可通過抑制Bcl-2表達，促進細胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除miRNA-34a基因小鼠的聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bcl-2表達增高，敲除SIRT6基因小鼠的聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bcl-2表達降低，兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明miRNA-34a與SIRT6均可調(diào)控Bcl-2表達，進而調(diào)控聽覺皮層神經(jīng)元細胞的凋亡。

Bax是線粒體凋亡途徑的主要效應基因，線粒體蛋白可與Bax復合，在缺氧時，Bax表達增高，引起細胞變性，進而發(fā)生凋亡。本研究對各組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bax進行了檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bax表達降低，SIRT6敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Bax表達增高，兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明敲除SIRT6敲除可引起小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，而這種凋亡的發(fā)生可能與缺氧相關，敲除miRNA-34a可抑制小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，表明miRNA-34a可促進聽覺皮層神經(jīng)元凋亡、而SIRT6可抑制聽覺皮層神經(jīng)元凋亡，但二者對內(nèi)耳聽毛細胞的凋亡中的作用以及介導細胞生物過程的機制復雜，仍需深入研究。

外源性細胞凋亡途徑是細胞凋亡的主要途徑，以Caspase8為起始基因，Caspase8表達增高也可引起炎癥反應，促進細胞炎癥因子表達，誘導細胞變性，從而發(fā)生凋亡，凋亡又可引起Caspase8過表達，形成惡性循環(huán)。因此，Caspase8過表達通常被認為是細胞凋亡的開始。此外，Caspase8也可可抑制RIPK3和MLKL介導的壞死性壞死，即使是失活的Caspase8也能引起小鼠胚胎致死。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Caspase8表達降低，SIRT6敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Caspase8表達增高，兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明miRNA-34a與SIRT6均參與調(diào)控外源性細胞凋亡途徑的發(fā)生。Caspase3是多種細胞凋亡途徑的最下游基因，Caspase3表達增高則可說明凋亡被執(zhí)行。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a敲除組與SIRT6敲除組小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞中Caspase3表達相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明敲除miRNA-34a與SIRT6基因后，小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡的情況有所不同，miRNA-34a可促進聽覺皮層神經(jīng)元凋亡、而SIRT6可抑制聽覺皮層神經(jīng)元凋亡。

近年來miRNA-34a與SIRT6在其他組織器官中的相關性研究較多，多數(shù)學者發(fā)現(xiàn)miRNA-34a與SIRT6在細胞凋亡中的作用負相關[14]，但在聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡中的作用罕見報道。本研究對miRNA-34a組與SIRT6在老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)的相關性研究表明，兩者呈負相關，其中miRNA-34a促使小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，SIRT6抑制小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，二者在老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡中的作用負相關，可通過敲除miRNA-34a或增加SIRT6阻止小鼠聽覺皮層神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述，敲除miRNA-34a可以抑制老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，敲除SIRT6可以促進老齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元細胞凋亡，兩者在調(diào)控老

齡小鼠聽覺皮層神經(jīng)元凋亡中負相關，其作用途徑可能與Bcl-2抗凋亡作用相關，也可能與線粒體凋亡途徑、外源性細胞凋亡途徑相關。miRNA-34a與SIRT6可能是治療聽覺皮層神經(jīng)元損傷及老年性聾的新靶點。