任星橋，李曉彤，林小英，曾凡群，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室暨遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

右心室重構(gòu)主要表現(xiàn)為心臟形態(tài)擴(kuò)大，右心室壁厚度增加，心肌細(xì)胞肥大、凋亡等。研究表明，肺動(dòng)脈高壓疾病與右心室重構(gòu)的發(fā)生密切相關(guān)[1]，隨著肺動(dòng)脈壓力升高，引起右心室后負(fù)荷加重，繼發(fā)右心室重構(gòu)，嚴(yán)重可發(fā)展為右心衰竭，甚至死亡。野百合堿(Monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)模型是目前常用于研究心臟右心室重構(gòu)的病理模型[2]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，研究表明NO可松弛血管，維持血管張力，改善心肌收縮力并調(diào)節(jié)心臟氧耗[3]。在心肌細(xì)胞內(nèi)，NO經(jīng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生，可以活化可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，生成環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷，激活蛋白激酶G1(Protein kinase G1，PKG-1)，產(chǎn)生舒張血管，抑制心肌細(xì)胞肥大等多種作用。已有研究表明，通過(guò)上調(diào)eNOS可減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大；通過(guò)上調(diào)PKG-1的表達(dá)可改善去氧腎上腺素所誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大；上調(diào)PKG活性可減輕腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)所致新西蘭家兔左心室的舒張功能障礙[4-6]。但PKG-1在MCT誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)中的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在探討eNOS和PKG-1在MCT所致大鼠右心室重構(gòu)中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 MCT(產(chǎn)品編號(hào)：C2401-1G，Sigma公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：GK5012，上海捷瑞生物工程有限公司)；eNOS小鼠單克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)：ab76198，abcam公司)；PKG-1兔單克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)：#3248，Cell Signaling公司)；β-actin兔多克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)：AF7018，Affinity公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(產(chǎn)品編號(hào)：S0001，Affinity公司)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(產(chǎn)品編號(hào)：SA00001-1，Proteintech公司)。

1.2 儀器 PowerLab/8SP生物監(jiān)測(cè)儀(澳大利亞AD instruments公司)；光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；5417R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean3電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；ChemiDoc成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 180～200 g雄性SD大鼠18只，無(wú)特定病原體(Specific pathogen-free animal，SPF)級(jí)，購(gòu)買(mǎi)于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011]。經(jīng)SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件：相對(duì)恒定室溫19～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，將所有SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組，n=8)和模型組(MCT組，n=10)。其中MCT組大鼠采用頸背部一次性皮下注射MCT(55 mg/kg)，建立右心室重構(gòu)模型，Control組大鼠同MCT組方法注射等體積生理鹽水。所有大鼠每日給予等量維持飼料及等體積雙蒸水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 造模28 d后，大鼠稱(chēng)重，采用右心導(dǎo)管術(shù)檢測(cè)右心室壓。大鼠頸部剪去毛發(fā)，剪開(kāi)右側(cè)皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，游離鎖骨下靜脈。將連接壓力傳感器的導(dǎo)管慢慢推入右側(cè)鎖骨下靜脈，經(jīng)右心房插入右心室，采集右心室壓力波形。

1.4.2 大鼠右心室質(zhì)量指數(shù)的測(cè)定 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后摘取心臟，迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中清洗，分離右心室游離壁，濾紙蘸干水分后，稱(chēng)重記錄，計(jì)算右心室質(zhì)量指數(shù)=右心室質(zhì)量/體重。

1.4.3 H&E染色 取大鼠右心室組織置于4%甲醛溶液中，固定48 h。脫水、石蠟包埋、制備組織切片，進(jìn)行H&E染色，于Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察右心室病理學(xué)變化。

1.4.4 Western Blot檢測(cè)大鼠右心室組織eNOS和PKG-1蛋白水平 稱(chēng)取大鼠右心室組織約100 mg，剪碎，加入1 mL裂解液(RIPA裂解液：PMSF溶液：蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)，使用勻漿器于冰上進(jìn)行組織勻漿，于冰上靜置裂解30 min，4 ℃、12 000 rpm離心15 min，吸取上清液。BCA法測(cè)定上清液的蛋白含量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠(上層5%濃縮膠，下層8%分離膠)，蛋白樣品經(jīng)電泳分離后，使用半干轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶搖床室溫封閉3 h，TBST洗去牛奶(每次10 min，共3次)，4 ℃過(guò)夜孵育一抗(16 h以上)：eNOS(1∶1 000)、PKG-1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，TBST洗膜，室溫孵育二抗(1∶5 000)40 min、TBST洗膜后使用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)，于成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Graphpad prism 5軟件進(jìn)行繪圖，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠右心室最大壓的變化 造模后第28天，與Control組相比，MCT組大鼠右心室最大壓升高72.4%(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

#：vs Control，P<0.05;n=5～6。圖1 大鼠右心室最大壓變化

2.2 大鼠一般狀況、體重、右心室質(zhì)量指數(shù)變化 Control組大鼠毛色光澤、呼吸平穩(wěn)、體重逐漸增加；MCT組大鼠毛色發(fā)暗、呼吸急促、活動(dòng)和進(jìn)食減少、體重逐漸減輕。造模后第28天，與Control組相比，MCT組大鼠體重明顯降低(P<0.05)，右心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P<0.05，見(jiàn)表1)。期間MCT組大鼠自發(fā)性死亡4只，Control組大鼠無(wú)自發(fā)性死亡。

表1 大鼠體重和右心室質(zhì)量指數(shù)的變化(n=6～8)

2.3 大鼠右心室組織病理學(xué)變化 H&E染色發(fā)現(xiàn)，Control組大鼠右心室無(wú)明顯病理學(xué)損傷，其心肌細(xì)胞排列有序，細(xì)胞核形態(tài)正常；MCT組大鼠右心室心肌細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞間質(zhì)增加，部分心肌細(xì)胞胞核寬大、形態(tài)不規(guī)則(見(jiàn)圖2)。

A:Contol；B:MCT。圖2 大鼠右心室病理變化(400×)

2.4 大鼠右心室組織eNOS蛋白表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，MCT組大鼠右心室組織eNOS蛋白表達(dá)下調(diào)52.3%(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

#：vs Control，P<0.05；n=4。圖3 大鼠右心室eNOS蛋白表達(dá)的變化

2.5 大鼠右心室組織PKG-1蛋白表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，MCT組大鼠右心室組織PKG-1蛋白表達(dá)下調(diào)44.1%(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

#：vs Control，P<0.05；n=4。圖4 大鼠右心室PKG-1蛋白表達(dá)的變化

3 討論

右心室肥大是右心室負(fù)荷過(guò)重引起的心室腔擴(kuò)張，心肌收縮力減弱，多見(jiàn)于肺動(dòng)脈高壓、先天性心臟病、慢性肺源性心臟病、風(fēng)濕性心臟病等疾病。MCT是一種吡咯烷生物堿，主要存在于豬屎豆屬植物中。MCT有明顯的肺毒性，其肺毒性是MCT經(jīng)肝代謝后生成野百合堿吡咯，進(jìn)入體內(nèi)破壞肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌增殖，肺動(dòng)脈壓升高，繼發(fā)右心室重構(gòu)，嚴(yán)重可發(fā)展為右心衰竭，甚至死亡[7]。本研究選用MCT頸背部一次性皮下注射建立右心室重構(gòu)模型。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，MCT組大鼠體重明顯減輕，右心室質(zhì)量指數(shù)和右心室最大壓明顯升高；右心室心肌細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂，部分心肌細(xì)胞細(xì)胞核寬大、形態(tài)不規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明右心室重構(gòu)模型構(gòu)建成功，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[8-9]。

生理性NO是細(xì)胞內(nèi)重要信使分子，參與調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等多種功能。eNOS具有合成NO的能力，NO激活細(xì)胞漿中可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，生成環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷，進(jìn)而激活PKG，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度降低，對(duì)心臟起到一定保護(hù)作用。PKG又稱(chēng)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷依賴(lài)型蛋白激酶，有PKG-1和PKG-2兩種類(lèi)型，其中PKG-1主要位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，且只有PKG-1在心血管組織中表達(dá)[10-11]。PKG-1通過(guò)擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集以及對(duì)心肌細(xì)胞的負(fù)性肌力作用保護(hù)心血管系統(tǒng)。研究表明，上調(diào)eNOS水平可改善異丙腎上腺素所致心衰大鼠模型的左心室重構(gòu)；玉郎傘MHBFC通過(guò)上調(diào)eNOS可改善腹主動(dòng)脈變窄術(shù)誘導(dǎo)的大鼠左心室重構(gòu)[12-13]。另有報(bào)道指出，左心室重構(gòu)的發(fā)生與缺乏PKG密切相關(guān)；PKG活性降低可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大[6,14]。因此，我們推測(cè)下調(diào)eNOS，進(jìn)而下調(diào)PKG-1的表達(dá)可能參與右心室重構(gòu)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與Control組大鼠相比，MCT組大鼠右心室組織中eNOS和PKG-1蛋白的表達(dá)明顯降低，這說(shuō)明在MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室重構(gòu)的過(guò)程中，eNOS和PKG-1蛋白的表達(dá)被抑制。

綜上所述，eNOS和PKG-1表達(dá)的下調(diào)可能參與了MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室重構(gòu)。