吳殿超，霍志斌， 趙笑楓

(河北省邢臺市人民醫(yī)院 胃腸腫瘤外科，河北 邢臺 054031)

結(jié)腸癌屬于消化系統(tǒng)高發(fā)病率惡性腫瘤，原發(fā)于結(jié)腸黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病特點由粘膜層向漿膜層浸潤，產(chǎn)生淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，惡化病情。結(jié)腸癌的產(chǎn)生原因較復(fù)雜，環(huán)境因素占據(jù)本病發(fā)生的80%，剩余與家族遺傳癌變基因等相關(guān)[1]。目前，結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，手術(shù)及放化療能夠治療結(jié)腸癌，但是部分患者會出現(xiàn)術(shù)后腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，威脅患者生命健康[2]。因此，尋找新型有效的治療方法是改善患者的重要手段。

lncRNA屬于超過200 nt的長鏈非編碼RNA，其生物功能具有廣泛性，能夠通過調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄在不同疾病中發(fā)揮不同作用。隨著人們研究深入，lncRNA與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。長鏈非編碼RNA(lncRNA)母系表達(dá)基因3(Maternally expressed gene 3,MEG3)是潛在的腫瘤抑制物，定位于染色體14q32，被研究學(xué)者證實在肝癌、肺癌等惡性腫瘤中能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，并在上述惡性腫瘤中表達(dá)缺失[3]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)又稱促血管素，最初在腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，能夠提高血管通透性。文獻(xiàn)表示，VEGF在不同腫瘤細(xì)胞中表達(dá)及功能也存在差異[4]，然而，目前關(guān)于MEG3對結(jié)腸癌細(xì)胞及VEGF的文獻(xiàn)較少，因此，本文通過探討MEG3對結(jié)腸癌細(xì)胞生物活性及VEGF水平影響，現(xiàn)研究內(nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購自中國上海信裕生物科技。

1.2 主要試劑與儀器 MEG3mimics、MEG3-NC購自中國廣東Invitrogen公司合成；VEGF和GAPDH抗體購自USA Abeam公司；MTT、DMSO均購自中國上?；鄯f生物；8517型超低溫冰箱購自USA FORMA公司；MLB倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；GAPDH購自上海北諾生物科技有限公司。

1.3 SW480細(xì)胞培養(yǎng) 將低溫冷藏的人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，快速移入37 ℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入RPMI培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁生長，次日更換新的培養(yǎng)液，生長到90%時，加入蛋白液消化，1～3傳代37 ℃保存，以備后用。

1.4 細(xì)胞分組及處理方法 將SW480細(xì)胞分為對照組(SW480細(xì)胞)、NC組(SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染MEG3-NC)和MEG3組(SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染MEG3mimics)，細(xì)胞全部融合后，放入200 μL轉(zhuǎn)染液體和4 μL脂質(zhì)體，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行，分別加入MEG3-NC、MEG3mimics后，培養(yǎng)36 h，次日更換培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染8h后PCR檢測轉(zhuǎn)染是否成功。

1.5 QRT-PCR檢測MEG3表達(dá) 將3組SW480細(xì)胞加入胰蛋白酶消化，進(jìn)行PBS沖洗，并加入1.5mL lncRNA MEG3載體試劑提取RNA，取細(xì)胞懸液30 mg放于EP管中，利用 Trizol 提取細(xì)胞總mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA,內(nèi)參基因是GAPDH，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：98 ℃ 6 min，98 ℃ 28 s，75 ℃ 30 s,80 ℃ 4 min，總計55個循環(huán)。引物序列見表1。

1.6 MTT法檢測SW480活性 轉(zhuǎn)染后各組SW480細(xì)胞，接種于96板中，分別轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，加入100 mL的MTT液，培養(yǎng)4 h后，加入150 μL DMSO振蕩，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光值(A)，觀察SW480細(xì)胞增殖情況，描繪生長曲線，細(xì)胞生長抑制率=[1-(實驗組/對照組)]×100%。

1.7 Transwell小室法檢測SW480細(xì)胞侵襲能力 將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37 ℃下呈凝膠狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)目為1×105/mL，上室中加入細(xì)胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，37 ℃，培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)基，拭去殘留細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，于倒置顯微鏡下拍照、計數(shù)。隨機(jī)選擇4個視野，計算SW480侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后的對數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)目為1×105/mL SW480細(xì)胞，采用40 g/L的多聚甲醛固定0.5 h，采用TrintonX-100透明處理，加入Hoechst熒光染色，常溫下0.5 h后，細(xì)胞凋亡：SW480細(xì)胞核固縮，呈現(xiàn)碎片狀，凋亡率=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.9 免疫印跡檢測VEGF蛋白水平 轉(zhuǎn)染后的對數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)目為1×105/mL SW480細(xì)胞重懸細(xì)胞，冰上裂解60 min后，進(jìn)行13 000 rpm離心10 min，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。采用40 μg的上樣量進(jìn)行10%電泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，5 min/次，分別加入VEGF、GAPDH(1∶1 000)，加入羊抗兔(1∶1 000)、過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)，分別雜交，PBS沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進(jìn)行檢測，獲取圖象。

1.10 免疫組化檢測VEGF陽性表達(dá) 轉(zhuǎn)染后各組SW480細(xì)胞進(jìn)行爬片處理，入2%甲醛，固定，75%、85%及95%梯度酒精脫水，觀察膠原沉積，蘇木精染色觀察VEGF陽性表達(dá)。陽性表達(dá)：以淺棕色至黃棕色為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測3組SW480細(xì)胞lncRNA MEG3相對表達(dá) 對照組和NC組SW480細(xì)胞lncRNA MEG3相對表達(dá)量分別為1.00±0.00和1.05±0.04比較無意義(P>0.05)，MEG3組表達(dá)升高與其余組別存在意義(P<0.05，見圖1)。

*：與對照組相比， P<0.05；#：與NC組相比， P<0.05。圖1 3組SW480細(xì)胞lncRNA MEG3相對表達(dá)

2.2 MTT檢測 MEG3對3組SW480細(xì)胞抑制率比較 不同時間點，對照組及NC組SW480抑制率水平相似(P>0.05)，與MEG3組比較，對照組及NC組SW480抑制率均降低(P<0.05)，相同時間點，MEG3組SW480抑制率均對照組及NC組(P<0.05)，對照組及NC組SW480抑制率水平相似(P>0.05，見表1)。

2.3 Transwell小室法檢測MEG3對3組SW480細(xì)胞侵襲數(shù)目比較 對照組，NC組及MEG3組SW480細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為(48.90±7.71)個，(44.12±6.90)個及(22.30±3.26)個，對照組、NC組細(xì)胞侵襲數(shù)目相似(P>0.05)，MEG3組細(xì)胞侵襲數(shù)目低于其他兩組(P<0.001)，見圖2。

表2 MEG3對3組SW480細(xì)胞抑制率比較

A:對照組；B：NC組；C：MEG3組；*：與對照組相比， P<0.05；#：與NC組相比， P<0.05。圖2 MEG3對3組SW480細(xì)胞侵襲數(shù)目比較

2.4 Hoechst染色檢測MEG3對3組SW480細(xì)胞凋亡率比較 對照組、NC組及MEG3組SW480細(xì)胞凋亡率分別為(7.46±0.72)%，(8.12±1.03)%及(31.13±3.22)%，對照組、NC組細(xì)胞凋亡率相似(P>0.05)；與對照組、NC組比較，MEG3組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05，見圖3)。

A:對照組；B：NC組；C：MEG3組；*：與對照組相比， P<0.05；#：與NC組相比， P<0.05。圖3 MEG3對3組SW480細(xì)胞凋亡率比較

2.5 免疫印跡檢測3組SW480細(xì)胞中VEGF蛋白相對表達(dá) 對照組、NC組及MEG3組SW480中VEGF蛋白相對表達(dá)水平分別為1.00±0.00，0.91±0.04及0.48±0.05，對照組、NC組VEGF蛋白表達(dá)相似(P>0.05)；與對照組、NC組比較，MEG3組VEGF蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.05，見圖4)。

A:對照組；B：NC組；C：MEG3組；*：與對照組相比， P<0.05；#：與NC組相比， P<0.05。圖4 3組SW480細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)

2.6 免疫組化檢測3組SW480細(xì)胞中VEGF陽性表達(dá) 棕黃色為陽性細(xì)胞，對照組、NC組及MEG3組SW480中VEGF陽性表達(dá)不同，對照組、NC組SW480中VEGF陽性表達(dá)分別為(9.60±1.22)%和(10.30±1.30)%相似(P>0.05)， MEG3組(2.30±0.40)%中VEGF陽性表達(dá)低于對照組、NC組(P<0.05，見圖5)。

A:對照組；B：NC組；C：MEG3組。圖5 3組SW480細(xì)胞中VEGF陽性表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌的產(chǎn)生是多因素發(fā)展共同結(jié)果，與患者肥胖、飲食習(xí)慣及低體力勞動相關(guān)。結(jié)腸癌患者初期可表現(xiàn)為排便習(xí)慣改變，后期變現(xiàn)為血便及腹部腫脹疼痛，并伴隨不明原因的消瘦等，早期患者5年生存率達(dá)到80%左右[5]。長鏈非編碼RNA是由多個核苷酸組成的具有調(diào)節(jié)DNA表達(dá)的非編碼RNA。近些年，研究表示，它參與了細(xì)胞生長、失活、淋巴浸潤等，DNA影響癌細(xì)胞生物活性[6]。MEG3屬于其中之一，已經(jīng)被證實在抑制食管癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞發(fā)揮重要作用，但是，在結(jié)腸癌中作用還需進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)表明，VEGF及其受體異常表達(dá)能夠提高惡性腫瘤生物活性[7]。本文通過對結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染MEG3觀察其生物活性及VEGF水平研究分析。

MEG3在機(jī)體腦組織內(nèi)表達(dá)水平最高，在機(jī)體其他組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較低。研究表示，在在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞內(nèi)MEG3幾乎無表達(dá)，這與以往研究文獻(xiàn)相似[8]。MEG3作為天然分子結(jié)構(gòu)體能夠通過基因調(diào)控細(xì)胞活性，在結(jié)腸癌細(xì)胞中敲減MEG3能夠加快癌細(xì)胞增殖，表示MEG3能夠作為抑癌因子發(fā)揮作用[9]。趙月鳴等[10-11]研究表示，MEG3過表達(dá)抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，提高了Bax的表達(dá)，說明MEG3可啟動腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制。MEG3提高Caspase-9水平，MEG3可以通過激活內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡主要通過線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控，其中Caspase12為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子，MEG3能夠啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加快結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制其活性[14]。本文研究表示在腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MEG3能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長，減少惡性侵襲，加快凋亡。研究機(jī)制轉(zhuǎn)染長鏈非編碼RNA MEG3能夠通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，降低VEGF水平，加快結(jié)腸癌凋亡。

眾多文獻(xiàn)證實，VEGF過表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤生長，增加血管生成。目前，研究中有多個血管因子被證實，VEGF過表達(dá)能夠提高結(jié)腸惡性腫瘤生長營養(yǎng)成分，加快腫瘤體積生長[15-16]。VEGF對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及生長起著關(guān)鍵作用，VEGF可促進(jìn)腫瘤血管再生，其腫瘤細(xì)胞機(jī)體大小均受到VEGF水平的干預(yù)。VEGF是重要的促血管生長因子，能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，能夠改變血管密度及血管的通透性，引導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，穩(wěn)定新生血管，是腫瘤生長的重要條件[17]。在體外實驗研究表示，在腦梗死大鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)VEGF水平及其受體顯著升高，檢測MEG3呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，表示MEG3失活是導(dǎo)致血管生成的主要原因[18]。MEG3為長鏈非編碼RNA，能夠抑制腫瘤生存，減少癌細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌細(xì)胞中MEG3的過表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，MEG3通過和VEGF通路的相互作用，對腫瘤新生血管的生成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤。在結(jié)腸癌細(xì)胞中激活MEG3水平能夠加快p53活性進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)VEGF轉(zhuǎn)錄。但是其研究機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本文研究表示，MEG3組結(jié)腸癌細(xì)胞中VEGF蛋白水平、陽性表達(dá)均低于對照組和NC組，說明在結(jié)腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MEG3能夠降低VEGF表達(dá)，減少腫瘤再生，這與朱棟良等[20]研究結(jié)果相似。

綜上所述，在結(jié)腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MEG3能夠抑制其活性，加快凋亡，其研究機(jī)制可能與MEG3能夠抑制VEGF表達(dá)相關(guān)，VEGF表達(dá)降低可改變血管的通透性，減少腫瘤血管新生，從而降低結(jié)腸癌細(xì)胞活性。