孫熙浛,齊 欣,崔承弼,*

(1.延邊大學農學院,吉林延吉 133002;2.延邊大學藥學院,吉林延吉 133002)

高山紅景天為紅景天屬景天科植物,其根在西伯利亞和亞洲的傳統(tǒng)醫(yī)學體系中扮演重要角色。紅景天生長在高海拔和強紫外線照射的區(qū)域,由于其長期適應缺氧、大風、干燥、高寒等惡劣的自然生態(tài)環(huán)境,故具有吸收水分和保濕的功能。紫外線或強光刺激皮膚,會引起深褐色的色素沉著和斑點。這些色素沉著的形成主要是由酪氨酸激酶催化多巴等物質的產(chǎn)生所引起。紅景天可抑制酪氨酸激酶活性[1],從而防止黑色素沉著和暗褐色斑點的形成。經(jīng)常暴露在紫外線下的皮膚和眼睛,是自由基最活躍的地方,自由基會侵犯皮膚組織,加速其老化。紅景天具有抗氧化性[2],能夠抵御自由基損壞,延緩衰老過程。除此之外,紅景天還具有降血脂[2]、抗疲勞[3]、抗抑郁[4]、抗炎[5]、抗衰老[6]、耐缺氧[7]、調節(jié)免疫力[8]、肝保護[9]、抑制腫瘤轉移[10]等功效。研究證明,紅景天能提高工作效率和抗應激能力,可預防氧化應激引發(fā)的相關疾病[11],還可治療代謝紊亂[12]和不穩(wěn)定型心絞痛[13],并具有治療糖尿病的藥理特性[14]。紅景天在抗焦慮、壓力和認知方面的積極作用也有報道[15-16],但尚無輻照處理紅景天提取物的抗氧化及美白作用方面的研究。

輻照食品是采用放射性60Co的γ射線、X射線或高能電子束等穿過食物機體,使其中的水分和各種營養(yǎng)物質發(fā)生電離作用后,破壞細胞內的DNA分子,消滅并除去食物中的微生物、害蟲等,以使食物表面及內部發(fā)生生物、化學性的改變[17]。CAC指出允許根據(jù)所需目標用高于10 kGy的輻照劑量對樣品進行處理,并強調了10 kGy以上的輻照也是安全的[18]。齊仕博等[19]發(fā)現(xiàn)一定劑量的輻照能提升參制品中人參皂苷的活性。在前期試驗基礎上,發(fā)現(xiàn)輻照處理能提高紅景天的活性成分,所以對輻照處理紅景天進一步研究。

本試驗所用紅景天于四川省原子能研究院進行60Co-γ射線進行輻照處理,輻照劑量分別設置為5、10、20、30 kGy,通過70%乙醇提取其活性成分進行DPPH自由基清除實驗、ABTS自由基清除實驗、鐵離子還原能力(FRAP)實驗、酪氨酸酶抑制實驗及小鼠B16黑色素瘤細胞實驗,研究5、10、20、30 kGy60Co-γ射線輻照紅景天和未輻照紅景天提取物的抗氧化作用及美白作用,為輻照紅景天乙醇提取物在抗氧化作用及美白作用上的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高山紅景天 由長白山科學研究院提供并于四川省原子能研究院進行輻照處理;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 英駿生物技術有限公司;2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪(TPTZ) 比利時Acros organics公司;2,2′-聯(lián)氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS) 美國Fluka公司;維生素C(VC) 北京化學試劑公司;3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) 上海江萊生物科技有限公司;L-酪氨酸(L-tyrosine,Tyr) Sigma試劑公司產(chǎn);酪氨酸酶(EC 1. 14. 18. 1,tyrosinase,TYR) 諾維信(中國)生物技術有限公司;PBS pH=7.4,Gibco公司,10010023,500 mL;B16(小鼠黑色素瘤細胞) 中國科學院上海細胞庫。

60Co-γ輻照源 四川省原子能研究院;MCO-5AC CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司;DTC-22B真空泵 日本ULUAC KIKO公司;LyoQuest-85實驗型冷凍干燥機 西班牙Telstar集團;紫外可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司;電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;96孔板 BIOFIL公司;FE20t型pH計 Mettler Toledo公司;1510全波長Multiskan GO酶標儀 Thermo Fisher公司;XH-B型旋渦混合器 江蘇天翎儀器有限公司;TG16-II型離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅景天材料的處理 將紅景天根莖破碎,在80 ℃條件下烘干,用40目型粉碎機進行粉碎,得到紅景天粉末。包裝好的紅景天粉末送至四川省原子能研究院進行輻照處理[20],以60Co-γ射線為輻照源,輻射距離37 cm,樣品的平鋪厚度3 mm,用重鉻酸鉀(銀)劑量計進行劑量追蹤,輻照劑量分別設置為5、10、20、30 kGy,未經(jīng)過輻照的用0 kGy表示。每組250 g紅景天,劑量率均為1 kGy/h,輻照時間分別為5、10、20、30 h,每個劑量設3次重復。處理后的紅景天置于冰箱冷藏室內4 ℃貯存?zhèn)溆?。在前期的預試驗中發(fā)現(xiàn)原料和提取物經(jīng)輻照處理后對紅景天而言沒有差異,因此選擇原料輻照后進行本試驗。

1.2.2 紅景天提取物的制備 用質量分數(shù)為70%的乙醇按照料液比1∶10在80 ℃水浴中提取1 h,以3000 r/min離心20 min后收集上清液。根據(jù)上述條件提取沉淀物,共進行三次提取,并蒸發(fā)濃縮收集的上清液,冷凍干燥,將最終提取物粉末密封并儲存以用于隨后的實驗。

1.2.3 輻照對紅景天提取物抗氧化能力的影響

1.2.3.1 清除DPPH自由基能力檢測 參照文獻[21],稱量不同輻照劑量紅景天提取物0.05 g,溶于適量無水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得樣品溶液1 mg/mL,分別將其稀釋得0.500、0.100、0.020、0.010、0.005、0.002、0.001 mg/mL的樣品溶液,總反應體系為3.0 mL。不同輻照劑量紅景天提取物清除DPPH自由基反應體系示于表1。

表1 不同輻照劑量紅景天提取物清除DPPH自由基反應體系

按照表1所示試劑的順序依次添加到試管中,搖勻,避光靜置30 min,以4000 r/min離心10 min,取上清液,在517 nm處分別測定吸光度Ai、A0、Aj。以標準VC為陽性對照。

分析所得數(shù)據(jù),并根據(jù)式(1)求得樣品對DPPH自由基的清除率。

式(1)

1.2.3.2 清除ABTS自由基能力檢測 參照文獻[22],稱量不同輻照劑量紅景天提取物0.05 g,溶于適量無水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得樣品溶液1 mg/mL,將其稀釋得0.50、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05 mg/mL的樣品溶液。總反應體系為5.1 mL。不同輻照劑量紅景天提取物清除ABTS自由基反應體系示于表2。

按照表2所示試劑的順序依次添加到試管中,搖勻,靜置6 min,在734 nm處分別測定吸光度Ai、A0、Aj。以標準VC為陽性對照。

分析所得數(shù)據(jù),并根據(jù)式(2)求得樣品對ABTS自由基的清除率。

式(2)

1.2.3.3 鐵離子還原法 參照文獻[23],稱量不同輻照劑量紅景天提取物0.25 g,溶于適量無水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得樣品溶液5 mg/mL,將其稀釋得3.0、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的樣品溶液。

以硫酸亞鐵(FeSO4)為標準,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2 mmol/L的FeSO4標準液,加入2.4 mL FRAP工作液,在37 ℃水浴中混勻10 min,于593 nm處測定其吸光度,用超純水調零,繪制標準曲線,測定其抗氧化性(FRAP值)。

樣品的測定:依次加入0.1 mL不同濃度的樣品溶液,加入2.4 mL FRAP工作液,在37 ℃水浴中混勻10 min,于593 nm處測定其吸光度,用超純水調零。以標準VC為陽性對照。FRAP活性計算為FeSO4當量,即硫酸亞鐵/紅景天提取物的濃度,其產(chǎn)生的吸光度值等于1 mmol/L FeSO4的吸光度值。

1.2.4 酪氨酸酶抑制實驗 參照文獻[24],稱量不同輻照劑量紅景天提取物0.05 g,溶于適量無水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得樣品溶液1 mg/mL,將其稀釋得0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05 mg/mL的樣品溶液?？偡磻w系為1.4 mL。不同輻照劑量紅景天提取物抑制酪氨酸酶反應體系示于表3。

按照表3所示試劑的順序依次添加到試管中,搖勻,置于37 ℃條件下水浴加熱20 min,在475 nm處分別測定各組吸光度。以標準VC為陽性對照。

分析所得數(shù)據(jù),并根據(jù)式(3)求得樣品對酪氨酸酶的抑制率。

式(3)

式中,A為含有酪氨酸酶但不含樣品的反應體系的吸光度值;B為不含酪氨酸酶且不含樣品的反應體系的吸光度值;C為含有酪氨酸酶且含有樣品的反應體系的吸光度值;D為不含酪氨酸酶但含有樣品的反應體系的吸光度值。

1.2.5 小鼠B16黑色素瘤細胞實驗

1.2.5.1 黑色素合成抑制率測定 稱量不同輻照劑量紅景天提取物0.05 g,溶于適量無水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得樣品溶液1 mg/mL,將其稀釋得0.10、0.07、0.05、0.03、0.01 mg/mL的樣品溶液。

取對數(shù)期的B16黑色素瘤細胞,棄去培養(yǎng)液,用PBS清洗2次,加入培養(yǎng)液,調節(jié)細胞密度為2×105個/mL接種于96板,每孔加入100 μL。孵育24 h后,棄上清液并加入樣品溶液,設置對照組(細胞+培養(yǎng)基)。樣品作用48 h后,吸去培養(yǎng)液用0.25%胰酶消化,以1000 r/min離心5 min,棄上清液,每個因素處理下的細胞加入500 μL含10%二甲基亞砜(DMSO)的NaOH(1 mol/L)溶液,振蕩5 min后,分別測量490 nm和570 nm處各孔吸光度值。

分析所得數(shù)據(jù),并根據(jù)式(4)求得樣品對黑色素合成的抑制率。

式(4)

式中,A為樣品孔在490 nm處吸光度值,B為樣品孔在570 nm處吸光度值,C為對照孔在490 nm處吸光度值,D為對照孔在570 nm處吸光度值。

1.2.5.2 相對細胞活率測定(MTT法) 培養(yǎng)小鼠B16黑色素瘤細胞,取對數(shù)生長期的細胞,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,制成單細胞懸液計數(shù),調整細胞濃度為5×104個/mL,反復吹打使細胞均勻,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。孵育24 h后,棄去原培養(yǎng)液,加入不同濃度樣品溶液(0.01%、0.05%、1.00%、2.00%,均為質量分數(shù)),每個濃度設置三個復孔和對照組(細胞+培養(yǎng)基),培養(yǎng)48 h后,將20 μL 5 g/L MTT溶液添加到每個孔中,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄孔內上清培養(yǎng)液,每孔加入100 μL細胞裂解液,孵育過夜后,測量570 nm處各孔吸光度值。

分析所得數(shù)據(jù),并根據(jù)式(5)求得樣品對黑色素細胞的相對細胞活力。

式(5)

式中,A為對照組平均吸光度值,B為藥物組平均吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件處理,單因素方差分析,重復次數(shù)3次,取平均值。通過濃度與清除率(抑制率)的變化擬合曲線計算出樣品和VC清除DPPH自由基和ABTS自由基(抑制酪氨酸酶)的IC50值。

2 結果與分析

2.1 輻照對紅景天提取物抗氧化能力的影響

2.1.1 輻照對紅景天提取物清除DPPH自由基效果的影響 不同輻照劑量紅景天提取物對DPPH自由基的清除活性如圖1所示,在濃度為1～20 μg/mL范圍內,0、5、10、20、30 kGy輻照組紅景天提取物清除DPPH自由基的IC50值分別為6.17、5.74、4.96、3.75、4.48 μg/mL,VC清除DPPH自由基的IC50值為3.18 μg/mL,紅景天提取物濃度與DPPH自由基的清除率呈正相關。在實驗濃度范圍內,5、10、30 kGy輻照組紅景天提取物對DPPH自由基均有一定的清除能力,但與未輻照(0 kGy)組無顯著性差異(P>0.05),在濃度為5、10 μg/mL時,20 kGy輻照組紅景天提取物對DPPH自由基的清除率與未輻照(0 kGy)組差異顯著(P<0.05),當濃度增大到20 μg/mL時,20 kGy輻照組紅景天提取物對DPPH自由基的清除率比未輻照(0 kGy)組高5.3%±0.07%,而對照組VC對DPPH自由基的清除率比未輻照(0 kGy)組高9.21%±0.04%,差異極顯著(P<0.01)。不同輻照劑量紅景天提取物對DPPH自由基的清除能力由大到小依次為:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

圖1 不同輻照劑量的紅景天提取物和VC對DPPH自由基的清除活性

2.1.2 輻照對紅景天提取物清除ABTS自由基效果的影響 在濃度為50～350 μg/mL范圍內,0、5、10、20、30 kGy輻照組紅景天提取物清除ABTS自由基的IC50值分別為68.70、66.27、62.57、44.88、55.60 μg/mL,VC清除ABTS自由基的IC50值為21.73 μg/mL,紅景天提取物濃度與ABTS自由基的清除率呈正相關。由圖2可知,在實驗濃度范圍內,5、10、30 kGy輻照組紅景天提取物對ABTS自由基均有一定的清除能力,但與未輻照(0 kGy)組無顯著性差異(P>0.05),在濃度為50、100、150 μg/mL時,20 kGy輻照組紅景天提取物對ABTS自由基的清除率與未輻照(0 kGy)組差異顯著(P<0.05),當濃度增大到350 μg/mL時,20 kGy輻照組紅景天提取物對ABTS自由基的清除率比未輻照(0 kGy)組高2.09%±0.06%,而對照組VC對ABTS自由基的清除率比20 kGy輻照組高8.29%±0.09%。不同輻照劑量紅景天提取物對ABTS自由基的清除能力由大到小依次為:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

圖2 不同輻照劑量的紅景天提取物和VC對ABTS自由基的清除活性

2.1.3 鐵離子還原能力的影響 FeSO4的標準曲線為y=0.4768x+0.1996,R2=0.9994,由圖3可知,在紅景天提取物濃度為10～200 μg/mL范圍內,不同輻照劑量紅景天提取物對鐵離子的還原能力隨著紅景天提取物濃度的增加而增強,總體呈現(xiàn)線性關系。經(jīng)不同劑量60Co-γ射線輻照處理后,不同濃度紅景天提取物對鐵離子的還原能力存在差異,在50～200 μg/mL范圍內,5、10、30 kGy輻照組紅景天提取物對鐵離子的還原能力與未輻照(0 kGy)組差異不顯著(P>0.05),而20 kGy輻照組紅景天提取物對鐵離子的還原能力顯著高于未輻照(0 kGy)組(P<0.05)。當紅景天提取物濃度為200 μg/mL時,20 kGy輻照組的FRAP值為(1.90±0.05) mmol/mg,而當VC濃度僅為10 μg/mL時,FRAP值為(105.15±0.05) mmol/mg,VC對鐵離子的還原能力極顯著高于同濃度下各輻照劑量對鐵離子的還原能力(P<0.01)。不同輻照劑量紅景天提取物對鐵離子的還原能力由大到小依次為:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

圖3 不同輻照劑量的紅景天提取物的FRAP值

2.2 輻照對紅景天提取物抑制酪氨酸酶效果的影響

如圖4所示,不同輻照劑量紅景天提取物對酪氨酸酶均有一定的抑制作用,在濃度為50～500 μg/mL范圍內,0、5、10、20、30 kGy輻照組紅景天提取物抑制酪氨酸酶的IC50值分別為589.62、525.90、454.37、244.10、406.05 μg/mL,VC抑制酪氨酸酶的IC50值為99.16 μg/mL,紅景天提取物濃度與酪氨酸酶的抑制率呈正相關。在濃度為100～500 μg/mL范圍內,5、10、30 kGy輻照組紅景天提取物對酪氨酸酶的抑制率與未輻照(0 kGy)組差異不顯著(P>0.05),20 kGy輻照組紅景天提取物對酪氨酸酶的抑制率與未輻照(0 kGy)組差異顯著(P<0.05),而VC對酪氨酸酶的抑制率極顯著高于未輻照(0 kGy)組的抑制率(P<0.01)。不同輻照劑量紅景天提取物對酪氨酸酶的抑制能力由大到小依次為:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

圖4 不同輻照劑量的紅景天提取物和VC對酪氨酸酶的抑制活性

2.3 輻照對紅景天提取物抑制黑色素合成及黑色素細胞相對活率的影響

采用B16細胞為實驗體系,觀察紅景天提取物作用后的黑色素合成抑制率的變化,結果見圖5。當紅景天濃度為100 μg/mL時,0、5、10、20、30 kGy輻照組紅景天提取物對黑色素瘤細胞黑色素合成抑制率分別為35.04%±0.02%、39.06%±0.03%、38.08%±0.01%、41.12%±0.01%、40.25%±0.02%,不同輻照劑量紅景天提取物的抑制能力由大到小依次為:20 kGy>30 kGy>5 kGy>10 kGy>0 kGy,表明不同輻照劑量紅景天提取物均表現(xiàn)出明顯的黑色素合成抑制能力,且呈劑量依賴關系,其中輻照劑量為20 kGy的紅景天提取物的抑制效果最佳。

圖5 不同輻照劑量的紅景天提取物對黑色素瘤細胞合成黑色素的抑制作用

由圖6可知,當紅景天濃度為0.50%時,0、5、10、20、30 kGy輻照組紅景天提取物對黑色素細胞的相對細胞活力分別為84.69%±0.06%、86.99%±0.08%、86.97%±0.07%、89.30%±0.07%、87.91%±0.09%,在低于0.50%的受試濃度下,各輻照組紅景天提取物的細胞活力均在80%以上,且不同輻照劑量的紅景天提取物在細胞活力上無顯著性差異(P>0.05)。表明不同輻照劑量的紅景天提取物在0.50%質量濃度下對細胞無毒副作用,實驗所用濃度均在安全范圍內。

圖6 不同輻照劑量的紅景天提取物對黑色素細胞相對活力的影響

3 討論

氧化應激被認為是許多慢性疾病[25]的主要發(fā)病機制之一。正因如此,抗氧化行為是植物提取物中常被確定的生物活性之一[26]。在測定紅景天提取物的抗氧化活性時,使用了DPPH測定法、ABTS測定法和FRAP測定法,使用3種測定方法可以提高紅景天提取物抗氧化能力的總體評價,每個分析結果反映了紅景天提取物抗氧化行為的不同方面,結合這些數(shù)據(jù)相比從單一分析中獲得的數(shù)據(jù)可以更好地描述抗氧化活性。FRAP法與DPPH法、ABTS法分析紅景天提取物的結果高度相關,具有相似的機械觀點,即從抗氧化劑中轉移電子以減少氧化劑[27]。但在FRAP實驗中出現(xiàn)了兩個問題,即在紅景天提取物中加入FRAP工作液會出現(xiàn)顏色的干擾,并且顏色變化緩慢。前者可能是由于FRAP法所用的酸性pH,而DPPH法、ABTS法的問題要小得多。其他研究報告[28-30]中也提到了顏色變化緩慢的問題,并指出了多種抗氧化劑進行實驗時觀察到的反應,每種抗氧化劑在不同的動力學條件下起作用。紅景天提取物可以顯著地抑制黑色素瘤細胞合成黑色素,表明紅景天提取物是一種高效的、無毒性的黑色素合成抑制劑。

近年來有許多國內外學者對紅景天提取物的抗氧化及美白作用進行了大量的研究。尹秀梅等[31]用70%乙醇提取長白紅景天,發(fā)現(xiàn)濃度為248 μg/mL時其對DPPH自由基的清除率達到90.34%。陳健[32]采用超高壓提取法對紅景天進行提取,當其達到最大測定濃度20 mg/mL時對DPPH自由基的清除率為63.93%±8.41%,其抗氧化活性要高于同濃度下回流、超聲、微波提取法得到的紅景天提取物的抗氧化活性。付晶晶等[33]研究發(fā)現(xiàn),當紅景天提取物濃度為400 μg/mL時,其對DPPH自由基和ABTS自由基的抑制率分別為84%和82%左右。Kosakowska等[34]通過DPPH法、ABTS法和FRAP法發(fā)現(xiàn),與水提取物和干燥原料相比,紅景天乙醇提取物具有較強的抗氧化能力。本試驗通過DPPH法、ABTS法和FRAP法對未輻照和輻照紅景天提取物的體外抗氧化活性進行研究,發(fā)現(xiàn)輻照劑量為20 kGy時紅景天提取物的效果最好。周思思[35]采用DPPH、ABTS、FRAP三種體系檢測紅景天乙醇提取物的抗氧化活性,結果顯示高濃度(800 μg/mL)時,紅景天乙醇提取物具有較強的抗氧化能力,這與本試驗結果一致。

趙進等[36]利用水提法從紅景天根中提取活性成分,結果發(fā)現(xiàn)質量分數(shù)為0.4%的紅景天提取液對自由基的清除率幾乎達到了同濃度下VC溶液的水平,并且具有體外抑制酪氨酸酶活性的能力。王雪梅等[37]研究發(fā)現(xiàn)1 mg/mL紅景天乙醇提取液對DPPH自由基的抑制率為98.5%±0.9%,濃度為10 mg/mL時其對酪氨酸酶的抑制率為85.1%±0.8%。龔靜[38]研究發(fā)現(xiàn)紅景天50%醇熱浸提液濃度為2.0 g/L時其對酪氨酸酶的效果達80%,比紅景天水提液的效果更好。Chiang等[39]研究表明紅景天提取物可抑制小鼠黑色素細胞黑色素的合成和酪氨酸酶活性,可作為皮膚美白劑。本試驗通過酪氨酸酶抑制實驗和小鼠B16黑色素瘤細胞實驗對未輻照和輻照紅景天提取物的美白作用進行研究,發(fā)現(xiàn)輻照劑量為20 kGy時紅景天提取物的美白效果最好。劉有停等[40]采用超聲提取的方法制備紅景天提取液,結果顯示在質量分數(shù)為1.00%時,紅景天提取液對酪氨酸酶和小鼠黑色素細胞合成黑色素的抑制率分別為為79.1%和39.0%,說明紅景天提取液具有良好的美白功效,其結果與本試驗相一致。王英存等[41]研究發(fā)現(xiàn)紅景天提取液體積分數(shù)為0.125%時,其對DPPH自由基的清除率達到了71%;在體積分數(shù)為0.5%時,其對酪氨酸酶的抑制率為48%,同時,紅景天提取物能夠顯著地減少小鼠B16細胞黑色素的生成,與本研究結果一致。

4 結論

與輻照前(輻照劑量為0 kGy)相比,不同劑量的60Co-γ射線輻照處理后,紅景天提取物均具有良好的抗氧化活性及美白作用,且輻照劑量為20 kGy的紅景天提取物抗氧化及美白效果最好。