王賽男,于寒松,谷春梅,賀 陽,張 田,徐錫奇

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118)

隨著人們生活節(jié)奏加快和膳食結(jié)構(gòu)改變,長期高脂飲食(HFD)會引發(fā)肥胖癥等一系列慢性疾病[1-2]。目前,肥胖癥發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)飛速增長,已成為備受關(guān)注的公共健康問題[3-4]。肥胖人群多選擇節(jié)食和藥物治療來減肥,但常伴有嚴(yán)重的副作用。研究證明攝入來自全谷物、蔬菜和水果的膳食纖維(Dietary fiber,DF)可以降低肥胖癥的患病風(fēng)險[5-6]。因此,調(diào)整膳食結(jié)構(gòu),攝入DF是預(yù)防肥胖的安全舉措之一。中國是大豆的主要生產(chǎn)國和最大消費國,每年生產(chǎn)約2000萬噸豆渣[7-8]。然而,豆渣通常作為飼料或直接拋棄,造成了嚴(yán)重的資源浪費和環(huán)境問題[9]。豆渣中DF的含量可占豆渣干物質(zhì)的50%～60%,其中不溶性膳食纖維(Insoluble dietary fiber,IDF)占DF總量的90%以上,是IDF較好的來源[10-11]。

研究認(rèn)為脂質(zhì)代謝紊亂是引發(fā)肥胖的原因,而脂質(zhì)代謝過程受到眾多信號通路調(diào)控,包括脂肪酸、甘油三酯(TG)合成及脂肪酸氧化等[12]。其中二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1(DGAT1)、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2(DGAT2)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)是甘油三酯合成關(guān)鍵酶[13]。此外,過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)在肝臟中高度表達(dá),主要是通過增強其靶基因肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a(CPT1a)的表達(dá),促進(jìn)脂肪酸β氧化,在代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[14-15]。隨著對DF參與機體糖脂代謝研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)DF可以通過調(diào)節(jié)糖原合成、減少糖異生、調(diào)控脂質(zhì)合成和分解代謝等途徑來緩解糖脂代謝紊亂[16-17]。其中可溶性膳食纖維(Soluble dietary fiber,SDF)的健康益處已被廣泛研究和應(yīng)用[18-19],而IDF更多地被認(rèn)為僅對促進(jìn)腸道蠕動有益[20]。目前,關(guān)于IDF參與宿主脂質(zhì)代謝的作用機制方面報道較少,張春霞等[21]發(fā)現(xiàn)山楂I(xiàn)DF可以參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)過程,改善機體血脂水平,但并未進(jìn)行機理研究。Chang等[22]研究了梨果渣中IDF的抗肥胖作用,但其主要分析IDF對機體腸道菌群的變化,并未深入探究IDF參與脂質(zhì)代謝的作用機制。此外,Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠日常飲食中添加豆渣,可以通過上調(diào)肝臟中PPARα表達(dá)水平,下調(diào)FAS表達(dá)水平來緩解肥胖,但沒有對豆渣中的IDF提取物進(jìn)行相關(guān)研究。

綜上所述,雖然已有報道證實豆渣的IDF具有調(diào)節(jié)血脂的功效,但對豆渣的IDF提取物調(diào)節(jié)血脂及其機制的研究還未見報道,且前期研究發(fā)現(xiàn)豆渣DF可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因表達(dá)水平達(dá)到緩解機體肥胖的效果,因此本文以大豆不溶性膳食纖維(SIDF)為研究對象,探究其對HFD誘導(dǎo)小鼠肥胖的預(yù)防作用及其在基因水平上的作用機制,為SIDF作為功能成分預(yù)防肥胖提供更深入的理論依據(jù),同時提高豆渣的附加值和綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆不溶性膳食纖維(純度>90.5%) 實驗室自制;總膽固醇(T-CHO)測試盒、甘油三酯(TG)測試盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測試盒、葡萄糖(GLU)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;小鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海泛柯實業(yè)有限公司;6周齡C57BL/6J雄性小鼠 50只,平均體重18～22 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2014-0004;基礎(chǔ)飼料、高脂飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

CPA-125電子天平 德國Sartorius公司;葉拓101系列鼓風(fēng)干燥箱 上海葉拓儀器儀表有限公司;KL04-A離心機 美國Agilent公司;HBS-1096B酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;Toptical196梯度熒光定量PCR儀 德國耶拿分析儀器股份有限公司;F013030045手持式勻漿器 美國Dremel公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及飼養(yǎng) 雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機分為5組:正常飲食對照組(ND)、高脂飲食對照組(HFD)、不溶性膳食纖維低(LSIDF)、中(MSIDF)、高劑量組(HSIDF),每組10只小鼠,每籠飼養(yǎng)5只。由于SIDF具有良好的吸水性和膨脹性,其灌胃劑量依據(jù)Ma等[24]和石彥囯等[25]的報道,稍作修改。ND組和HFD組灌胃生理鹽水,SIDF低、中、高劑量組灌胃劑量分別為250 mg/kg、500 mg/kg、1 g/kg BW/d。各組的飼料配比如表1,除ND組飼喂基礎(chǔ)飼料外,其余各組飼喂高脂飼料[26]。持續(xù)飼喂20周,攝食量及小鼠體重分別每天及每周進(jìn)行監(jiān)測記錄。動物實驗?zāi)┢?將所有小鼠隔夜禁食12 h,眼球采血,3500 r/min 15 min離心后取上清備用。取肝臟、腹部脂肪、附睪脂肪及腎周脂肪,稱重后-80 ℃條件儲存。

表1 飼料的組成

1.2.2 體重和攝食量 實驗過程中每周定時分別對各組小鼠進(jìn)行稱重并記錄,精確到0.1 g。每次投放適量的食物,投放前對飼料進(jìn)行稱重,隔天稱余下飼料的重量(各組小鼠籠盒中的大塊殘渣稱量記錄,殘渣碎屑忽略不計),計算每日食物攝入量。

1.2.3 血清中脂類指標(biāo)的測定 取各組小鼠血清,測定各組小鼠血清中總膽固醇(TC)、TG,高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白脂蛋白(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的含量。

1.2.3.1 TC含量測定 選用96孔板操作,分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和各組樣本孔,向空白孔中加入2.5 μL蒸餾水,標(biāo)準(zhǔn)孔中加入2.5 μL校準(zhǔn)品,樣本孔中加入2.5 μL血清,各個操作孔中均加入250 μL工作液,混勻,37 ℃孵育10 min,波長510 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值。TC含量按式(1)計算。

式(1)

1.2.3.2 TG含量測定 參照1.2.3.1中操作步驟,TG含量按式(2)計算。

式(2)

1.2.3.3 HDL-C含量測定 選用96孔板操作,分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和各組樣本孔,向空白孔中加入2.5 μL蒸餾水,標(biāo)準(zhǔn)孔中加入2.5 μL校準(zhǔn)品,樣本孔中加入2.5 μL血清,各個操作孔中均加入180 μL R1溶液,混勻,37 ℃孵育10 min,波長546 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值A(chǔ)1。向各個操作孔中加入60 μL R2溶液,混勻,37 ℃孵育5 min,波長546 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值A(chǔ)2。HDL-C含量按式(3)計算。

HDL-C含量(mmol/L)=[(樣本A2-樣本A1)-(空白A2-空白A1)]/[(標(biāo)準(zhǔn)A2-標(biāo)準(zhǔn)A1)-(空白A2-空白A1)]×校準(zhǔn)品濃度(mmol/L)

式(3)

1.2.3.4 LDL-C含量測定 參照1.2.3.3中操作步驟,LDL-C含量按式(4)計算。

LDL-C含量(mmol/L)=[(樣本A2-樣本A1)-(空白A2-空白A1)]/[(標(biāo)準(zhǔn)A2-標(biāo)準(zhǔn)A1)-(空白A2-空白A1)]×校準(zhǔn)品濃度(mmol/L)

式(4)

1.2.4 肝臟中脂類指標(biāo)的測定 準(zhǔn)確稱取各組小鼠肝臟組織100 mg,置于5 mL離心管中,按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,加入0.9 mL無水乙醇,冰水浴條件下機械勻漿,2500 r/min,離心10 min,取上清液測定各組小鼠肝臟中TC和TG含量,具體實驗步驟參照1.2.3.1和1.2.3.2進(jìn)行。

1.2.5 肝臟指數(shù)和脂肪系數(shù)的測定 分離出各組小鼠的肝臟、腹部脂肪、附睪脂肪和腎周脂肪組織,用生理鹽水清洗,濾紙吸干水分,稱量并記錄,肝臟指數(shù)按式(5)計算,脂肪系數(shù)按式(6)計算。

式(5)

式(6)

1.2.6 HE染色 將各組小鼠肝臟(約100 mg)浸于4%的多聚甲醛固定液中,常規(guī)石蠟包埋,石蠟切片,將石蠟切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡下從低倍到高倍依次觀察肝臟組織病理變化。

1.2.7 肝臟脂肪合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的測定

1.2.7.1 肝臟組織中總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 實驗方法根據(jù)劉清清[27]方法略有改動。采用Trizol法提取各組小鼠肝臟組織中總RNA,稱取肝臟組織50 mg,置于無RNA酶離心管內(nèi),加1 mL Trizol試劑,勻漿后每管加200 μL預(yù)冷的三氯甲烷,振蕩20 s,冰浴靜置15 min,4 ℃ 12000×g離心15 min,小心移取400 μL RNA上清液至離心管中,向每管加入等體積異丙醇沉淀RNA,室溫靜置10 min,4 ℃ 12000×g離心10 min,留取沉淀即為RNA,用75%乙醇洗滌,靜置5 min,4 ℃ 8000×g離心5 min,留取沉淀用無RNA酶水溶解并測定其濃度。根據(jù)測得濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制得cDNA于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.2 實時熒光定量PCR 將1.2.7.1所得的cDNA取2 μL于PCR管中,分別加入SYBR Green I染料12.5 μL,上下游引物各1 μL以及蒸餾水8.5 μL進(jìn)行PCR 擴增。各基因引物的上下游序列見表2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆不溶性膳食纖維對小鼠體重和攝食量的影響

如圖1(a)所示,SIDF干預(yù)期間,HFD組小鼠體重增加比ND組更快。補充SIDF 12周后,與HFD組相比,SIDF組小鼠體重增加開始逐漸減緩。SIDF干預(yù)20周時,與HFD組(38.56±1.15 g)相比,LSIDF、MSIDF、HSIDF組小鼠體重分別降低至(32.87±1.32)、(31.69±1.01)、(29.10±1.12) g(P<0.001),HSIDF組體重降低最為顯著。如圖1(b)所示,與ND組相比,HFD組攝食量顯著減少(P<0.05),但該組能量攝入較高。此外,SIDF干預(yù)組攝食量相對于HFD組有所減少(P>0.05)。結(jié)果表明,SIDF可控制小鼠體重增長,這是由于SIDF具有良好的吸水性和持水性,可以增加機體飽腹感,從而降低小鼠攝食量,進(jìn)而達(dá)到抑制或減緩小鼠體重增長的效果。此結(jié)果與汪平權(quán)等[9]關(guān)于豆渣對小鼠體重控制作用研究結(jié)果表現(xiàn)一致,說明SIDF發(fā)揮主要作用。由此可見,長期攝入SIDF能有效減緩HFD引起的機體體重增加,對預(yù)防肥胖具有積極作用。

圖1 SIDF對HFD誘導(dǎo)小鼠體重和攝食量的影響

表2 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物序列

2.2 大豆不溶性膳食纖維對小鼠血脂水平的調(diào)節(jié)作用

SIDF干預(yù)20周后,小鼠血清脂質(zhì)水平如圖2所示,與ND組相比,HFD組血清中TC、TG和LDL-C水平顯著升高,分別升高10.32%(P<0.05)、13.61%(P<0.01)、60.55%(P<0.001),HDL-C水平顯著降低 21.98%(P<0.01)。由此可見,長期HFD會導(dǎo)致血脂代謝紊亂。與HFD組相比,LSIDF、MSIDF和HSIDF組小鼠血脂水平得到改善,TC水平分別顯著降低8.97%(P<0.05)、15.11%(P<0.001)、11.19%(P<0.01),TG水平分別顯著降低9.11%(P<0.01)、22.11%(P<0.001)、26.22%(P<0.001),LDL-C含量顯著降低25.72%、31.42%、36.76%(P<0.001),HDL-C含量顯著升高28.15%、25.35%、39.49%(P<0.001)。實驗結(jié)果說明SIDF對HFD引起的血脂水平升高起到拮抗作用,其中SIDF組TC、TG、LDL-C水平下降,HDL-C水平升高。王康樂等[28]指出當(dāng)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂時,其血脂指標(biāo)一般表現(xiàn)為TC、TG、LDL-C水平升高,HDL-C水平降低。由此可見,SIDF可通過調(diào)節(jié)血脂水平來改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。其中,血清TG水平降低與SIDF可以結(jié)合脂肪,直接阻礙脂肪的吸收有關(guān)。此外,SIDF可抑制腸道內(nèi)TC的吸收,阻礙膽汁酸重吸收進(jìn)入肝腸循環(huán),導(dǎo)致膽汁酸和TC排出,同時HDL受體活性增強,可轉(zhuǎn)運血液中更多的TC轉(zhuǎn)移至肝臟分解代謝,因此導(dǎo)致血清中TC、LDL-C的含量降低,HDL-C含量升高從而實現(xiàn)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[29-30]。

圖2 SIDF對HFD誘導(dǎo)小鼠血清血脂水平的影響

2.3 大豆不溶性膳食纖維對小鼠肝臟脂質(zhì)水平的調(diào)節(jié)作用

圖3 SIDF對HFD誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響

小鼠肝臟脂質(zhì)水平如圖3所示,與ND組相比,HFD組小鼠肝臟TC水平顯著升高55.65%(P<0.001),TG水平升高至ND組的2.34倍(P<0.001)。與HFD組相比,LSIDF、MSIDF和HSIDF組小鼠肝臟中TC水平分別降低4.95%(P>0.05)、8.67%(P<0.05)、18.61%(P<0.001),TG水平分別降低17.75%(P<0.05)、56.97%(P<0.001)、44.5%(P<0.001),其中MSIDF和HSIDF組效果優(yōu)于LSIDF組。實驗結(jié)果表明SIDF可有效調(diào)節(jié)小鼠肝臟脂質(zhì)水平,降低TC、TG含量,由于SIDF可以促進(jìn)TC和膽汁酸的排泄,進(jìn)而加快肝臟中TC轉(zhuǎn)化為膽汁酸,因此間接導(dǎo)致肝臟TC、TG水平降低。報道已證實胡蘿卜和藜麥中IDF均可促進(jìn)TC和膽汁酸排出,進(jìn)而有效降低肝臟TC、TG水平[31-32]。因此攝入SIDF對HFD引起的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂具有調(diào)節(jié)作用,可有效降低肝臟中TC、TG水平。

2.4 大豆不溶性膳食纖維對小鼠肝臟指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響

由圖4可知,與ND組(35.99±3.36 mg/g)相比,HFD組(32.49±2.33 mg/g)肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.01),這與小鼠長期高脂飲食有關(guān)。與HFD組相比,LSIDF、MSIDF、HSIDF組肝臟指數(shù)分別為(28.88±2.02)、(29.63±4.07)、(29.27±2.89) mg/g(P<0.05),可能是由于攝入SIDF減少了肝臟脂肪堆積。由表3可知,與ND組相比,HFD組小鼠脂肪系數(shù)顯著升高(P<0.01),這與其體內(nèi)白色脂肪堆積有關(guān)。

圖4 SIDF對HFD誘導(dǎo)小鼠肝臟指數(shù)的影響

表3 SIDF對HFD誘導(dǎo)小鼠脂肪系數(shù)的影響

喬青蓮[33]認(rèn)為肥胖主要是由于脂肪組織的過度堆積造成的。與HFD組相比,SIDF組脂肪系數(shù)顯著降低(P<0.001),且HSIDF組優(yōu)于LSIDF和MSIDF組,存在劑量關(guān)系。此外,SIDF組腹部和腎周脂肪重量顯著減少(P<0.05)。實驗結(jié)果表明,攝入SIDF可降低小鼠肝臟指數(shù)和脂肪系數(shù),且其脂肪系數(shù)與SIDF攝入量呈負(fù)相關(guān)。白色脂肪組織的積累還會誘發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗、高血脂等代謝綜合征的重要原因[34]。因此攝入SIDF可通過減少體內(nèi)白色脂肪積累,降低肝臟脂質(zhì)變性的風(fēng)險,進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或緩解肥胖的目的。

2.5 肝臟組織病理學(xué)分析

由圖5可知,與ND組相比,HFD組的肝臟組織中脂肪空泡明顯,有大量脂滴聚集,存在細(xì)胞腫脹和核消失的現(xiàn)象,說明長期HFD會導(dǎo)致肝臟組織脂肪變性,有明顯病變的特征。SIDF組相比于HFD組,其肝臟組織中存在少數(shù)脂滴,細(xì)胞腫脹和核消失的現(xiàn)象有所緩解,且隨著SIDF攝入量增加,改善效果越好,說明攝入SIDF能后減少肝臟脂滴聚集,減少肝臟脂肪變性的風(fēng)險。

圖5 SIDF對小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)的影響(200×)

2.6 大豆不溶性膳食纖維對肝臟脂肪合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

SIDF干預(yù)20周后,小鼠肝臟甘油三酯合成相關(guān)基因表達(dá)水平如圖6(a)所示,DGAT1,DGAT2和SCD1是甘油三酯合成過程中的關(guān)鍵酶,與ND組相比,HFD組小鼠肝臟中DGAT1,DGAT2和SCD1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與HFD組相比,LSIDF和MSIDF組對DGAT1,SCD1 mRNA表達(dá)水平無顯著影響(P>0.05)。HSIDF組可顯著下調(diào)DGAT1,SCD1 mRNA表達(dá)水平,分別下調(diào)0.66倍、0.45倍(P<0.01)。SIDF干預(yù)組DGAT2 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)0.58、0.40、0.66倍,HSIDF組效果優(yōu)于LSIDF和MSIDF組,說明長期攝入SIDF可降低甘油三酯合成速率。

圖6 SIDF對HFD誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

小鼠肝臟脂肪酸合成分解相關(guān)基因表達(dá)水平如圖6(b),與ND組相比,HFD組FAS mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01),但長期干預(yù)后,MSIDF和HSIDF組FAS mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)0.59倍(P<0.01)、0.48倍(P<0.001)。與ND組相比,HFD組中CPT1a mRNA表達(dá)水平得到顯著抑制(P<0.01)。在干預(yù) 20 w后,FAS、CPT1a mRNA表達(dá)以劑量依賴性方式恢復(fù)至正常水平且差異顯著(P<0.05)。FAS、PPARα、CPT1a等被認(rèn)為是脂肪酸合成及β氧化過程中具有代表性的關(guān)鍵酶[26,35]。

由此可見,IDFS可以上調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平,同時下調(diào)脂肪酸β氧化相關(guān)基因表達(dá)水平。Kim等[23]研究發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠日常飲食中添加豆渣,可以通過上調(diào)肝臟中PPARαmRNA表達(dá)水平,下調(diào)FAS mRNA表達(dá)水平來緩解肥胖。通過本項研究認(rèn)為這可能主要歸因于SIDF。由此可見,SIDF可以作為功能成分,通過減少脂質(zhì)合成,加快脂質(zhì)分解來達(dá)到預(yù)防肥胖的目的。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明低、中、高劑量的SIDF均能減緩由HFD引起的體重增長,降低食物攝入量,并呈劑量依賴趨勢。經(jīng)長期干預(yù)可以有效降低小鼠血清和肝臟脂質(zhì)水平,還有助于減少體內(nèi)白色脂肪積累,且與SIDF攝入量呈正相關(guān)。HSIDF組通過下調(diào)DGAT1、DGAT2、SCD1及FAS mRNA表達(dá)水平來降低脂質(zhì)合成速率,同時上調(diào)PPARα和CPT1a mRNA表達(dá)水平來加速脂肪酸β氧化,促進(jìn)脂質(zhì)分解,可有效調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)水平。以上結(jié)果說明SIDF可以在基因水平上調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝過程,為SIDF預(yù)防肥胖提供了更深入的理論依據(jù),同時提高大豆的附加值和綜合利用。但仍存在許多不足,需進(jìn)一步探討SIDF抑制HFD誘導(dǎo)肥胖的信號通路及分子調(diào)節(jié)機制。