黃 薇，廖 茜，羅土炎，宋永康*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，福建 福州 350003； 2.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院， 福建 福州 350005)

抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes，ARGs)作為一種新型環(huán)境污染物，因其有自我擴增、容易轉移給其他細胞等生物學特征，在2015年已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為人類醫(yī)療健康面臨的三大威脅之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布將在全球范圍內(nèi)對控制ARGs進行戰(zhàn)略部署[1]。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖各種不同環(huán)境介質(zhì)中(水體、土壤、沉積物)均有ARGs檢出的報道，水產(chǎn)養(yǎng)殖場已經(jīng)成為環(huán)境中ARGs的儲存庫[2-3]。作為一個水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，在當前抗生素與ARGs污染日趨嚴峻的形勢下，加強水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染情況研究力度已刻不容緩，也責無旁貸[4]。

傳統(tǒng)檢測環(huán)境ARGs的方法主要是通過ARGs的PCR、定量PCR以及耐藥菌的培養(yǎng)篩選等，通過這些方法研究人員已經(jīng)從不同環(huán)境介質(zhì)中分離和鑒定了大量的ARGs，闡釋了不同ARGs的作用機制[5]。但是，傳統(tǒng)的研究分析方法具有一定的限制性，如大多的微生物不可培養(yǎng)、PCR結果的真實程度取決于設計引物的序列等，因此很難得到環(huán)境中微生物抗生素抗性基因組的全面和詳細的信息。近年來，基于功能的宏基因組篩選和基于高通量測序為基礎的宏基因組測序分析技術與方法的發(fā)展為研究環(huán)境抗生素抗性基因組的生態(tài)、起源、進化和傳播機制提供了最強有力的工具[6-7]。Wang等[8]和Fang等[9]利用高通量宏基因組測序分析技術使人們對海水養(yǎng)殖場以及養(yǎng)豬場所蘊藏ARGs的種類、分布和傳播途徑都有了更進一步的理解。

鰻鱺Anguilla.sp是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖出口創(chuàng)匯最多的品種之一，鰻鱺在人工養(yǎng)殖過程中疾病時有發(fā)生，其中細菌性疾病的危害最為嚴重，抗生素在養(yǎng)殖過程中被廣泛使用。然而，直至目前國內(nèi)外對鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的研究報道鮮見。因此，本研究選取鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境作為研究對象，運用高通量測序技術及功能宏基因組學分析方法，揭示在鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染現(xiàn)狀與分布特征，以期為鰻鱺的健康養(yǎng)殖、病害防控以及水生態(tài)環(huán)境調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年11月12日，選取三明市清流縣的1個典型養(yǎng)鰻場作為采樣點，在鰻鱺養(yǎng)殖場的3個養(yǎng)殖池分別收集底泥樣品100 g、養(yǎng)殖水1 L，樣品采集完畢后送實驗室4℃保存，48 h內(nèi)完成總基因組DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

底泥樣品分別取0.5 g采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒(MOBIO，Carlsbad，CA，USA)提取總基因組DNA；水體樣品先采用5.0 μm濾膜過濾以去除浮游動物和浮游植物，再經(jīng)過0.45 μm濾膜抽濾富集微生物。采用PowerWater DNA Isolation Kit試劑盒(MOBIO，Carlsbad，CA，USA)提取總基因組DNA；提取的DNA樣品用Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)進行定量，然后放置在-80℃下保存直至使用。

1.3 Illumina測序及高通量數(shù)據(jù)處理

為達到測序要求的DNA閾含量，分別將3個底泥和3個養(yǎng)殖水DNA樣品等量混合成1個底泥混合樣品和1個養(yǎng)殖水混合樣品送上海美吉生物公司采用Illumina Hiseq 2500測序平臺進行宏基因組測序。高通量測序原始數(shù)據(jù)先采用fastp軟件進行質(zhì)控去除接頭序列、低質(zhì)量堿基、N堿基及長度過短序列，利用Megahit與Newbler軟件對質(zhì)控數(shù)據(jù)進行多重混合拼接組裝，使用MetaGene軟件對拼接結果中的contigs進行ORF預測，采用CD-HIT軟件進行聚類(默認參數(shù)為：95% identity、90% coverage)，每個類取最長的基因作為代表序列，構建非冗余基因集，使用BLASTP軟件將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫進行比對(比對參數(shù)設置期望值e-value為1e-5)，并通過NR庫對應的分類學信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋結果，然后使用物種對應的基因豐度總和計算該物種的豐度，從而構建相應分類學水平上的豐度表，將數(shù)據(jù)上傳ARDB數(shù)據(jù)庫(http://ardb.cbcb.umd.edu/)進行比對(比對參數(shù)設置期望值e-value為1e-5)，獲得基因?qū)目股乜剐怨δ茏⑨屝畔ⅰ?/p>

2 結果與分析

2.1 高通量測序序列數(shù)據(jù)分析

鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中底泥與養(yǎng)殖水的DNA樣品經(jīng)Illumina平臺宏基因組測序共得到原始序列(Raw reads)42 935 336條和41 852 870條，質(zhì)控后的有效序列(Clean reads)42 532 836條和41 257 260條，占原始序列的99.06%和98.58%，混合拼接后得到Contigs 512 773條和275 869條序列，N50分別為630 bp和1854 bp；經(jīng)過基因預測得到ORFs的序列條數(shù)為642 119條和465 335條，通過聚類構建了837 326個基因的非冗余基因集。

2.2 鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境菌群結構和多樣性分析

利用BLASTP將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫比對進行物種分類注釋，共得到131個門水平、268個綱水平、590個目水平、1 067個科水平、2 764個屬水平和11 835個種水平的物種，其中注釋為真細菌、古細菌、病毒、真核生物以及未分類物種的序列數(shù)分別占總注釋序列數(shù)的96.88%、0.26%、1.24%、1.50%和0.12%。根據(jù)物種注釋結果，生成物種門水平和屬水平相對豐度柱形累加圖(圖1)。從圖1a可知，鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中底泥和養(yǎng)殖水的豐度最高的細菌門類為Proteobacteria，但優(yōu)勢菌群結構組成具有明顯差異。在底泥中，優(yōu)勢群體的門類(相對豐度>5%)為Proteobacteria(48.72%)、Chloroflexi(8.85%)、Actinobacteria(8.17%)、Cyanobacteria(8.01%)、Gemmatimonadetes(6.56%)和Bacteroidetes(6.28%)；而在養(yǎng)殖水中，優(yōu)勢門類為Proteobacteria(51.37%)、Bacteroidetes(32.44%)和Verrucomicrobia(6.52%)。從圖1b可知，在屬水平下，底泥中相對豐度在2%以上的細菌屬主要有Gemmatimonas(5.38%)、Rhodopseudomonas(3.23%)、unclassified_d_Bacteria(2.24%)、Oscillochloris(2.08%)和Methylibium(2.04%)，而養(yǎng)殖水的優(yōu)勢菌屬為Limnohabitans(12.00%)、Novosphingobium(6.29%)、Rhodobacter(4.98%)、Sediminibacterium(4.22%)、Haloferula(3.11%)、Haliscomenobacter(2.74%)、Flavobacterium(2.39%)、Emticicia(2.29%)和Acidovorax(2.25%)。

2.3 鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境微生物基因組抗性基因分析結果

將鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中底泥和養(yǎng)殖水的基因組數(shù)據(jù)上傳ARDB抗性基因數(shù)據(jù)庫進行ARGs的預測和注釋，底泥和養(yǎng)殖水分別注釋得到ARGs序列6 570條和19 356條，對鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中的抗性基因類型進行統(tǒng)計分析(表1)。從表1可知，底泥的ARGs數(shù)量比養(yǎng)殖水低，但ARGs種類比養(yǎng)殖水高。同時，在養(yǎng)殖環(huán)境介質(zhì)(底泥和養(yǎng)殖水)中的豐度較高的抗性類型均為四環(huán)素類、桿菌肽類和磺胺類抗生素，表明在鰻鱺養(yǎng)殖過程中，出現(xiàn)耐四環(huán)素、桿菌類以及磺胺類病原菌的機會相對較高。

在底泥中，共存在ARGs基因38種，歸屬于10類抗性類型。具體包括11種多重耐藥基因、2種鏈霉素類ARGs、1種桿菌肽類ARGs、1種青霉素類ARGs、4種氯霉素類ARGs、2種甲氧芐啶類ARGs、1種紅霉素類ARGs、1種氟喹諾酮類ARGs、2種磺胺類ARGs和13種四環(huán)素類ARGs。其中，豐度最高的抗性基因類型為四環(huán)素類、桿菌肽類和磺胺類抗生素，分別占底泥ARGs序列數(shù)的32.48%、27.00%和23.23%。在養(yǎng)殖水中，共存在9類29種ARGs基因抗性類型。具體包括7種多重耐藥基因、2種鏈霉素類ARGs、1種桿菌肽類ARGs、1種青霉素類ARGs、3種氯霉素類ARGs、3種甲氧芐啶類ARGs、1種紅霉素類ARGs、2種磺胺類ARGs和9種四環(huán)素類ARGs。其中，豐度最高的抗性基因類型同樣為四環(huán)素類、磺胺類和桿菌肽類抗生素，分別占養(yǎng)殖水ARGs序列數(shù)的31.44%、31.28%和22.30%。統(tǒng)計結果表明，鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境微生物中存在種類多樣且豐富的ARGs庫。

表1 鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境微生物基因組中注釋的抗生素抗性基因

3 討論

宏基因組測序方法不僅可以檢測ARGs的廣譜特征，同時還能檢測出環(huán)境微生物群落結構組成。從檢測結果可知，鰻鱺養(yǎng)殖水中的優(yōu)勢菌群門類為Proteobacteria、Bacteroidetes和Verrucomicrobia，這與項目組之前對鰻鱺腸道優(yōu)勢菌群的研究結果相似[10]，說明養(yǎng)殖水體與養(yǎng)殖水生物之間的微生物存在相互作用和相互影響。不同菌種攜帶ARGs的偏好性不同，環(huán)境ARGs的種類與豐度和細菌群落結構組成密切相關[7，11]。本研究下一步擬利用宏基因組測序方式對鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落與ARGs之間是否存在著連鎖效應、協(xié)同選擇和進化的關系進行分析。

從ARGs注釋結果可知，本研究共在鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中共檢測出39種ARGs，發(fā)現(xiàn)了許多未曾在鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中報道過的ARGs，如emrf、smee等。導致這些基因未曾報道的原因可能是由于這些基因的宿主(耐藥菌)難以培養(yǎng)或者是用于擴增這些基因的引物難以設計，這也進一步說明宏基因組測序分析方法比傳統(tǒng)方法更能全面地檢測出樣品中的ARGs[12]。在鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中，本研究檢測出了禁限用已久的抗生素——氯霉素類ARGs，說明歷史背景誘導產(chǎn)生的ARGs能夠在環(huán)境中長期穩(wěn)定的存在[13]。

在鰻鱺養(yǎng)殖底泥和養(yǎng)殖水中，豐度最高的抗性類型均為四環(huán)素類、桿菌肽類和磺胺類抗生素。這可能與鰻鱺養(yǎng)殖過程抗生素的使用方式及用途有關，抗生素殘留造成的環(huán)境選擇壓力與抗生素抗性的產(chǎn)生密切相關[14]。在鰻鱺養(yǎng)殖過程中，土霉素常用于鰻鱺開口料——紅蟲的殺菌與消毒；桿菌類抗生素對水產(chǎn)動物具有促生長增重作用，提高飼料轉化率的效果，常常作為飼料添加劑廣泛使用；磺胺類抗生素常被用于治療鰻鱺細菌型疾病。同時，在鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中，還檢測出豐度較高、種類繁多的多重耐藥基因，可能與鰻鱺環(huán)境中使用的多種抗生素造成的微生物選擇壓力或者細菌之間ARGs的交換有關[15]。本研究采用宏基因組測序分析技術明確了鰻鱺養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染特征，可以為指導鰻鱺養(yǎng)殖抗菌藥物的監(jiān)管提供必要的參考依據(jù)，對水產(chǎn)動物源病害防控具有重要的應用價值，同時也表明宏基因組測序技術檢測ARGs具有的可行性和優(yōu)越性。