李美辰，潘靖丹，范澤華，陳萬樓，陳彩鈴，吳合亮，李天歌，孫亞杰，杜孌英

在中國，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，對人類的健康和生命產(chǎn)生了巨大威脅[1]。根據(jù)全球腫瘤登記中心報(bào)告表明，肺癌發(fā)病率位居全國發(fā)病率首位，每年發(fā)病人數(shù)約為78.1萬人。根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)[2]，肺癌是最常見的癌癥，是癌癥死亡的主要原因。肺癌的病理類型分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌的惡性程度高于非小細(xì)胞肺癌，約占肺癌總數(shù)的14%左右[2]。旋毛蟲(Trichinellaspiralis)是一種人獸共患寄生蟲，據(jù)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲具有抑制腫瘤的作用。羅婧梅等[3]通過實(shí)驗(yàn)證明，旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(excretory-secretory proteins,ESPs)中含有抑制腫瘤生長的活性物質(zhì)，把肌幼蟲ESPs作用于小細(xì)胞肺癌H446后，能夠抑制其增殖，并誘導(dǎo)H446細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞，通過質(zhì)譜法分析細(xì)胞內(nèi)蛋白組分的變化情況，進(jìn)而觀察ESPs抑制小細(xì)胞肺癌H446增殖的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物、蟲株及細(xì)胞株 7周齡，清潔級，雄性昆明小鼠，體重20～30 g，購自承德醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。所用旋毛蟲為實(shí)驗(yàn)室小鼠保種的豬源旋毛蟲。小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 胃蛋白酶購自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司，氯化鈉購自天津市百世化工有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，青鏈霉素購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.3旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白的獲取 小鼠經(jīng)口灌胃感染旋毛蟲300條，35 d后采用頸椎離斷法處死，取小鼠全部橫紋肌置于攪拌機(jī)中粉碎，加入鹽酸、胃蛋白酶，于37 ℃恒溫水浴鍋中消化3～4 h，通過改良貝氏法收集肌幼蟲，除去肉渣和纖維，用含500 U/mL鏈霉素、青霉素的生理鹽水洗滌沉淀數(shù)次，100目無菌銅網(wǎng)過濾、沉淀，收集獲得純凈的肌幼蟲。按4 000～5 000條的密度放置于含有青、鏈霉素的無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的孵箱中培育24 h，選擇培養(yǎng)基清澈，死蟲率低的培養(yǎng)皿，10 000 r/min，4 ℃離心30 min，小心吸取上清，即獲得干凈的旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的培養(yǎng) 取出本實(shí)驗(yàn)室液氮保存的小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞，置于37 ℃溫水中緩慢融化，1 000 r/min，離心3 min后，棄掉凍存液，加入2 mL含有青鏈霉素和血清的RPMI1640培養(yǎng)基，混勻，加入培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加至5 mL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞形態(tài)，更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長到培養(yǎng)皿的85%～90%，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代，經(jīng)過3次傳代后取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5細(xì)胞總蛋白提取及SDS-PAGE分離 將處于對數(shù)生長期的小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞傳代至10 cm培養(yǎng)皿中，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，換液處理，待細(xì)胞長至85%～90%，把細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組。實(shí)驗(yàn)組加入0.85 mg/mL排泄分泌蛋白，對照組加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，分別作用24 h后，用PBS清洗細(xì)胞2次，用含0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，按照細(xì)胞裂解液說明書，分別提取各皿中的細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度的測定。配制12%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，每孔上樣80 μg，電壓80V轉(zhuǎn)至120 V進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。凝膠用0.1%考馬斯亮藍(lán)R250染色液經(jīng)過4 h染色后用乙醇-冰醋酸脫色液進(jìn)行脫色。脫至背景無色透明(圖1)。

1.6 質(zhì)譜鑒定和分析

1.6.1脫色 沿染色邊緣切下選定的含目的蛋白斑點(diǎn)的膠塊，切成1 mm小膠粒，100 mL含50%乙腈，50 mmol/L碳酸氫銨溶液浸泡脫色，棄去溶液，重復(fù)1～2遍至膠粒無色。

1.6.2還原烷基化 加50 μL乙腈脫水至膠粒變白，真空離心10 min干燥膠粒。加入25 mmol/L碳酸氫銨(含10 mmol DTT)50 μL，56 ℃水浴1h。冷卻至室溫后，吸干并快速加入50 μL 25 mmol/L碳酸氫銨(含55 mmol/L碘乙酰胺)，置暗室45 min。再用乙腈脫水10 min至膠粒變白，真空抽干10 min。

1.6.3酶解 在干燥膠顆粒中根據(jù)膠粒大小加入2～5 μL 10 ng/μL胰蛋白酶(溶于25 mmol/L碳酸氫銨)，加入適量25 mmol/L碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒，37 ℃孵育過夜(16～18 h)。加入50 μL含0.1%甲酸和50%乙晴振蕩搖勻，60 min后離心收集酶解液，加入50 μL 100%乙腈振蕩搖勻，60 min后離心收集上清液，合并抽干，使用0.1% FA復(fù)溶用于后續(xù)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。1.6.4LC-MS/MS檢測 液相色譜條件：色譜柱：Acclaim PePmap 100，C18富集柱(75 μm×20 mm，3 μm顆粒)；分析柱：自制一體柱，柱料：Venusil×BPC，C18(L)5 μm，150A(艾杰爾)(規(guī)格75 μm×150 mm，顆粒)。流速400 nL/min；流動相A：含0.1%甲酸水溶液；流動相B：含0.1%甲酸乙腈；質(zhì)譜條件：離子化方式：納升電噴霧正離子(ESI+)；數(shù)據(jù)采集模式：DDA方式，每次掃描中20個(gè)強(qiáng)度最高的離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析；離子源電壓：1 800 V；毛細(xì)管溫度：360 ℃；采集范圍：MS 350～2 000 m/z，二級掃描范圍依賴于一級母離子質(zhì)荷比自動選擇。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果 質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)組共含有240種蛋白質(zhì)，其中的204種為已明確鑒定的蛋白質(zhì)，22種為未明確鑒定的蛋白質(zhì)，14種為假定蛋白質(zhì)。從已知的204種蛋白質(zhì)中檢索出1種與抗腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)即組蛋白H2A(histone H2A)。質(zhì)譜分析對照組共含有233種蛋白質(zhì)，其中195種為已明確鑒定的蛋白質(zhì)，21種為未明確鑒定的蛋白質(zhì)，17種為假定蛋白質(zhì)。其中實(shí)驗(yàn)組和對照組的重合蛋白質(zhì)為191種，實(shí)驗(yàn)組和對照組的非重合蛋白質(zhì)為49種(表1)，對照組和實(shí)驗(yàn)組的非重合蛋白質(zhì)為42種。240種蛋白均可以在Uniport網(wǎng)站上查詢。

表1 ESPs組和對照組非重合蛋白

2.2蛋白功能富集分析 根據(jù)Gene Ontology 生物信息學(xué)分類，細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組多于對照組的已鑒定的49種蛋白質(zhì)中，屬于細(xì)胞器組分的占59.2%(29/49)、屬于細(xì)胞質(zhì)組分的占51%(25/49)、屬于細(xì)胞核組分的占32.7%(16/49)(表2)。

表2 已明確鑒定的蛋白質(zhì)GO細(xì)胞組分、分子功能及生物過程分類

分子功能富集分析顯示，這49種蛋白共具有142種分子功能，其中大部分參與結(jié)合、催化活性、核苷酸結(jié)合過程，還參與了DNA結(jié)合、水解酶活性等過程，所占比例較小的蛋白質(zhì)參與了磷酸酶活化、連接酶活化等過程，如具有催化活性的占44.9 %(22/ 49)，參與核苷酸合成過程的占39%(19/49)，參與DNA結(jié)合過程的占10.2%(5/49)，參與磷酸酶活化過程的占4.1%(5/49)等。生物過程的分析結(jié)果表明，鑒定的蛋白質(zhì)共參與了743種生物過程，大部分參與生物過程調(diào)節(jié)、多細(xì)胞生物發(fā)展過程，還參與了有機(jī)質(zhì)代謝過程、細(xì)胞大分子代謝等過程，所占比例較小的蛋白參與了DNA 構(gòu)象變化過程、凋亡過程、細(xì)胞通信調(diào)節(jié)等過程。

3 討 論

旋毛蟲是一種毛型科毛型種的寄生蟲，其成蟲寄生于哺乳動物腸道內(nèi)，其幼蟲寄生于橫紋肌細(xì)胞內(nèi)，是一種人獸共患的寄生蟲[3]。為了適應(yīng)其發(fā)育過程中不同的生活環(huán)境，旋毛蟲蟲體在不同發(fā)育階段分泌不同的蛋白質(zhì)，稱為排泄分泌蛋白或排泄分泌抗原。流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室研究證明旋毛蟲對抑制腫瘤生長有積極或消極作用[4]。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲的有效蛋白具有抑制腫瘤的作用，旋毛蟲能夠抑制肺癌[5]、白血病[6]、黑色素瘤[7]、肝癌[8]等惡性腫瘤。旋毛蟲肌幼蟲ESPs是通過提取旋毛蟲肌幼蟲，將其置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)吸取上清獲得的。課題組常紅敏[9]前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲肌幼蟲ESPs能夠抑制小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步研究旋毛蟲肌幼蟲ESPs能夠誘導(dǎo)H446細(xì)胞發(fā)生凋亡，后期研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲肌幼蟲ESPs能夠觸發(fā)線粒體凋亡通路誘導(dǎo)H446細(xì)胞發(fā)生凋亡，然而，ESPs是一種復(fù)雜的混合物，到底是哪些蛋白起了抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用以及作用的可能機(jī)制并不明確。因此，我們進(jìn)行了此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，把旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于H446細(xì)胞，與對照組相比，通過質(zhì)譜法觀察細(xì)胞組分的變化。LC-MS/MS是一種準(zhǔn)確度高，分離范圍廣的快速分離方法，它對化合物的結(jié)構(gòu)破壞性小，適合有機(jī)分子和生物分子的分離。質(zhì)譜具有其他分析方法無可比擬的靈敏度，對于未知化合物的結(jié)構(gòu)分析定性十分準(zhǔn)確，對相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品要求也比較低。

本文用LC-MS/MS質(zhì)譜法分析了旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的全部蛋白的組分。和對照組比較，實(shí)驗(yàn)組多出蛋白組分49種，對這49種蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)這49種蛋白具有催化活性等142種分子功能，參與代謝過程、胚胎發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)等743種生物過程(表2)。課題組Luo JM等[10]運(yùn)用LC-MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲ESPs中有6種與抗腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)。但旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于H446細(xì)胞后，從實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中只鑒定出H2A一種。推斷組蛋白H2A可能通過某種方式進(jìn)入了細(xì)胞里，對于旋毛蟲肌幼蟲ESPs抗腫瘤發(fā)揮了重要作用。

組蛋白是由H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成的組蛋白八聚體，位于真核細(xì)胞染色體基本單位—核小體中[11]。王蓓莉等[12]對討論核心組蛋白H2A在乳腺癌組織中的表達(dá)以及乳腺癌患者預(yù)后生物因素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TNM分期越早，H2A表達(dá)越高，低表達(dá)的H2A常提示TNM分期晚，H2A的低表達(dá)提示更低的生存率，可能提示H2A有抑制腫瘤的作用。Mir AR等[13]發(fā)現(xiàn)，糖氧化修飾組蛋白H2A與其他糖化蛋白和核酸產(chǎn)生交叉反應(yīng)，在癌癥患者中形成了高特異性抗體，可能提示H2A有抑制癌癥的作用。王蓓莉等[11]研究發(fā)現(xiàn)H2AX是組蛋白H2A的一種變體，被認(rèn)為是一種新的抑癌蛋白。 Balicki D等[14]發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了組蛋白H2A的scIL-12 細(xì)胞因子能有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)組和對照組的重合蛋白質(zhì)為191種，非重合蛋白質(zhì)分別有49種和42種，說明旋毛蟲肌幼蟲ESPs作用于H446細(xì)胞后，除去檢出抗腫瘤成分H2A外，細(xì)胞內(nèi)蛋白組分也發(fā)生了明顯而復(fù)雜的變化，作者推測旋毛蟲肌幼蟲ESPs抗腫瘤不是H2A單獨(dú)作用的結(jié)果，可能是多種物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，作用過程復(fù)雜。

利益沖突：無