(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院， 貴陽 550005)

西南紅山茶(Camelliapitardii)是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)植物，生于海拔1 000～2 400 m的林下、林緣或灌叢中。在貴州西部至中部、四川西南部至南部、云南南部至東南部、廣西北部、湖南西部和湖北西部均有分布。貴州盤州市是西南紅山茶的主要分布區(qū)，現(xiàn)有集中成片分布的野生林分約2 000 hm2。西南紅山茶樹型美觀，花朵美麗，是一種優(yōu)良的園林綠化樹種[1,2]；西南紅山茶籽油的脂肪酸組成與普通油茶籽油無差異，平均果油率9.2%，種仁含油率49.3%，不飽和脂肪酸含量87.29%，是貴州西部高海拔地區(qū)發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)的首選樹種[3]。目前，西南紅山茶的研究主要集中在脂肪酸組成、種質(zhì)資源收集、表型性狀變異及優(yōu)良單株選擇[4,5]等方面。ISSR(inter-simple sequence repeat)標(biāo)記技術(shù)具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，操作簡單等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、品種鑒定及親緣關(guān)系分析、基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇等方面[6-8]。桂騰琴等[9]對影響ISSR-PCR擴增的因子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，建立了荷花品種的ISSR-PCR最佳擴增體系；曾惠敏等[10]利用ISSR分子標(biāo)記，分析了八仙花的遺傳多樣；西南紅山茶多處于野生狀態(tài)，天然雜交形成了豐富的變異類型，本研究對>貴州西南紅山茶自然分布的6個野生居群的37個單株進(jìn)行ISSR分子遺傳多樣性分析，為野生西南紅山茶的合理開發(fā)和有效利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

表1 采樣地點及編號

圖1 856號引物瓊脂糖凝膠電泳圖

1 材料與方法

1.1 材料來源

材料來源于西南紅山茶自然分布的盤州市、威寧等地，每個居群隨機選取2～12株長勢健壯、無病蟲害的植株，采集葉片放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩９┰嚥牧暇幪柤安杉卦斠姳?。

1.2 實驗方法

1.2.1總DNA的提取

西南紅山茶的DNA采用北京索萊寶公司植物基因組DNA試劑盒提取，DNA提取、純化后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度及純度。用1×TE溶液稀釋至100 ng·μL-1后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2ISSR-PCR 反應(yīng)體系的建立

從合成的100條引物中篩選出6條多態(tài)性好的引物進(jìn)行PCR擴增，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立西南紅山茶ISSR-PCR最佳擴增體系，西南紅山茶ISSR-PCR擴增的引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.3PCR擴增產(chǎn)物的檢測及條帶統(tǒng)計

PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并拍照。

1.2.4條帶統(tǒng)計及數(shù)據(jù)處理方法

ISSR為顯性標(biāo)記，同一引物擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶具有同源性[11]。根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行條帶統(tǒng)計，同一位置強帶和弱帶均記為1，無記為 0，利用Popgene 32 軟件分別計算平均觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon 多樣性指數(shù)(I)等[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR擴增體系的建立

利用4個不同種源的西南紅山茶DNA對引物進(jìn)行篩選，最終篩選出6條多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物分別對37個西南紅山茶的DNA進(jìn)行擴增，經(jīng)優(yōu)化后的西南紅山茶ISSR-PCR 反應(yīng)體系為：ISSR-PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，其中DNA 模板2 μL(約200 ng)，引物2 μL(10 μmol)，2×Mix(10 μL)，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序為 94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增結(jié)果如圖1所示。

2.2 西南紅山茶ISSR擴增結(jié)果

從表1可以看出，用于西南紅山茶ISSR擴增的引物多態(tài)性高，共擴增出條帶89條，其中多態(tài)性條帶82條，多態(tài)性比例為92.13%，8條引物擴增的條帶數(shù)為12～18條，其中引物827擴增的條帶最多；多態(tài)性條帶為11～18條，平均為13.7條，其中引物827和引物845多態(tài)性最高，多態(tài)性比例達(dá)100%，擴增的條帶片段大小集中在300～900 bp之間。

2.3 西南紅山茶遺傳多樣性分析

利用 Popgene 32 軟件對6個野生西南紅山茶群體37個單株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，37個單株的平均觀察等位基因數(shù)(Na)為1.921 3，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.501 2，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.296 2，Shannon信息指數(shù)(I)為0.447 7，說明西南紅山茶單株間遺傳多樣性高，變異豐富。

2.4 西南紅山茶親緣關(guān)系分析

根據(jù)ISSR擴增結(jié)果對6個野生西南紅山茶居群的遺傳相似性進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)表明，6個居群的野生西南紅山茶的遺傳相似系數(shù)為0.705 9～0.936 7，遺傳距離為0.065 4～0.384 2，其中威寧和清鎮(zhèn)居群的西南紅山茶遺傳相似系數(shù)最低，為0.705 9；盤州市野生居群和畢節(jié)遺傳相似系數(shù)最高，達(dá)0.936 7；遺傳距離最小為0.065 4，由于居群1的分布點盤州市和居群2的分布點水城地理位置相近，氣候特征相似，導(dǎo)致2個居群的野生西南紅山茶相似性最大。

表2 不同引物的擴增結(jié)果

表3 遺傳相似度和遺傳距離

3 結(jié)論與討論

目前，分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于山茶屬植物的遺傳多樣性分析、品種鑒定、文庫構(gòu)建及重要基因的挖掘[13]，彭繼慶等[14]構(gòu)建了博白大果油茶的ISSR-PCR反應(yīng)體系；宋倩倩等[15]利用ISSR分子標(biāo)記對福建省浙江紅花油茶遺傳多樣性進(jìn)行了分析。本研究通過構(gòu)建西南紅山茶ISSR-PCR擴增體系，對貴州省6個居群37個西南紅山茶單株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，37個野生西南紅山茶多態(tài)性豐富、遺傳多樣性高；6條引物共擴增出89個條帶，其中多態(tài)性條帶82條，多態(tài)性位點百分率為92.13%；平均觀察等位基因數(shù)(Na)為1.921 3，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.501 2，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.296 2，Shannon信息指數(shù)(I)為0.447 7，說明貴州野生西南紅山茶變異豐富。李芳等研究表明，西南紅山果花的性狀變異豐富[2]；李彥福等對西南紅山茶果實性狀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，西南紅山茶單株在果高、果徑、果皮厚度、籽粒數(shù)、脂肪酸成分及含量等性狀間存在極顯著差異[5]，為西南紅山茶的選育提供了豐富的材料。ISSR-PCR擴增從分子水平揭示了西南紅山茶的遺傳多樣性。從遺傳相似系數(shù)和遺傳距離可以看出，野生西南紅山茶居群內(nèi)遺傳相似系數(shù)大，居群間相似度高，貴州省野生西南紅山茶的遺傳距離與實際的地理距離關(guān)系顯著，說明西南紅山茶的遺傳變異受環(huán)境因素影響較大。由于分布區(qū)內(nèi)海拔高差大，氣候多樣，形成了豐富的自然變異，為西南紅山茶的選育奠定了豐富的物種基礎(chǔ)；西南紅山茶是高海拔地區(qū)重要的木本油料樹種，本研究分析了貴州省西南紅山茶的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為西南紅山茶種質(zhì)資源的開發(fā)及品種配置提供了理論依據(jù)。