黃燕芬,2， 姜金仲,2， 朱守引， 趙 銀， 任佳欣

(1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550018；2.貴州省生物資源開發(fā)利用特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550018)

白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKiodz)屬菊科多年生草本植物[1]，為我國(guó)特產(chǎn)藥材之一，主產(chǎn)湖南、安徽等地，以根莖入藥。近現(xiàn)代藥理研究表明，白術(shù)主要含內(nèi)酯類化合物、多糖和揮發(fā)油[2]。白術(shù)具有調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗衰老、利尿、擴(kuò)張血管、抗炎、抑菌、鎮(zhèn)靜、降血糖等重要作用[3]。而目前我國(guó)白術(shù)中藥材的栽培存在產(chǎn)量低下、品種迅速退化、藥材質(zhì)量逐年降低、有效成分含量不穩(wěn)定等問(wèn)題，優(yōu)質(zhì)白術(shù)藥材在市場(chǎng)上供不應(yīng)求。白術(shù)適宜在海拔高、陰涼的山地生長(zhǎng)，不宜連作，需不斷采取開荒的方式種植，這對(duì)自然植被的損壞很大，也造成了種植地生態(tài)環(huán)境的破壞。為改善這類狀況，基于多倍體具有抗逆性強(qiáng)、巨型性、藥用有效成分高等特點(diǎn)[4]，利用人工誘導(dǎo)多倍體技術(shù)誘導(dǎo)培育多倍體白術(shù)種苗，一方面能夠提高白術(shù)種植的經(jīng)濟(jì)效益，為白術(shù)人工培育提供較優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，改變品種雜亂、質(zhì)量低下的現(xiàn)狀和防止病蟲害的影響，另一方面能夠使白術(shù)種植的環(huán)境成本降低，有效避免對(duì)自然植被的毀壞。此外，在藥材生產(chǎn)應(yīng)用上也具有很大的潛力。

1 材料與方法

1.1 材 料

白術(shù)試管播種快繁芽苗，保存于貴州省生物資源開發(fā)利用特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，白術(shù)種子采自貴陽(yáng)金實(shí)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司中藥材種植基地。

1.2 方 法

1.2.1白術(shù)同源多倍體誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)

1) 多倍體誘導(dǎo)單因素實(shí)驗(yàn)。選擇對(duì)誘導(dǎo)白術(shù)同源四倍體有直接影響的因素，秋水仙素滅菌方式、秋水仙素濃度、誘導(dǎo)處理時(shí)間等，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從芽苗成活率、芽苗變異率、四倍體誘導(dǎo)率等3方面考察其對(duì)白術(shù)多倍體苗誘導(dǎo)的影響。

2) 多倍體誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定秋水仙素滅菌方式的條件下，對(duì)秋水仙素濃度X 1、誘導(dǎo)處理時(shí)間X 2進(jìn)行考察，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以芽苗存活率(%)、芽苗變異率(%)、四倍體誘導(dǎo)率(%)為試驗(yàn)指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

3) 芽苗生根培養(yǎng)。選擇經(jīng)秋水仙素處理表現(xiàn)莖比較粗，葉片較厚且深綠的芽苗與二倍體芽苗一同轉(zhuǎn)接于1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA的生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)完整植株并獲得染色體倍數(shù)鑒定材料。

表2 秋水仙素不同滅菌方式及濃度對(duì)誘導(dǎo)白術(shù)多倍體的影響

表1 白術(shù)同源多倍體誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)

1.2.2白術(shù)同源四倍體形態(tài)解剖學(xué)觀察鑒定

參照汪衛(wèi)星等[5]和姚焱等[6]的方法(稍有調(diào)整)進(jìn)行鑒定。將白術(shù)二倍體和經(jīng)誘導(dǎo)處理的多倍體無(wú)菌試管苗的葉片，分別置于卡諾氏固定溶液中(乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定2～3 h后清洗干凈，撕下葉片同一部位的下表皮于載玻片上展平，滴1滴1% I-KI溶液，制成臨時(shí)裝片。每張片子隨機(jī)取5個(gè)視野觀察氣孔的大小及分布，統(tǒng)計(jì)葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目，用顯微測(cè)微尺隨機(jī)測(cè)量10個(gè)氣孔橫徑、縱徑。以平均數(shù)比較，初步篩選同源四倍體試管苗。觀察白術(shù)生根試管苗葉片的大小，莖的粗細(xì)，葉片厚度和顏色，并與白術(shù)二倍體試管苗做對(duì)比。

1.2.3白術(shù)同源四倍體細(xì)胞學(xué)鑒定

待二倍體苗和通過(guò)形態(tài)解剖鑒定篩選出的誘導(dǎo)苗根長(zhǎng)至1～2 cm長(zhǎng)時(shí)，參照向增旭等[7]和聶楊眉等[8]的方法，分別將其根尖切下，放入濃度為0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉溶液中進(jìn)行預(yù)處理，溫度為10～20 ℃。處理4 h后，洗干凈放入卡諾氏固定液中固定24 h。之后用蒸餾水洗凈放入0.075 mol·L-1KCl溶液中前低滲處理20～30 min，再放入0.2 mol·L-1HCl溶液中水浴解離5～10 min，溫度60 ℃，然后浸泡在蒸餾水中，低滲處理30 min，之后將根尖制成臨時(shí)裝片用顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)量。

1.2.4白術(shù)同源四倍體植株擴(kuò)繁及生根

通過(guò)形態(tài)解剖觀察鑒定和細(xì)胞染色體數(shù)量鑒定，初步篩選出同源四倍體試管苗。將其在無(wú)菌條件下切成單芽，接種于MS基本培養(yǎng)基附加6-BA 0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、1.5 mg·L-1，NAA 0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1，IBA 0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1的增殖培養(yǎng)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察記錄增殖倍數(shù)、增殖周期、芽苗生長(zhǎng)情況。待增殖培養(yǎng)結(jié)束，從中選擇壯苗接種于上述生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)長(zhǎng)根，獲得完整再生植株。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度(24±1)℃；相對(duì)濕度75%～85%；每天光照時(shí)間16 h；光照度1 500～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 白術(shù)多倍體誘導(dǎo)

2.1.1秋水仙素不同滅菌方式、濃度、處理時(shí)間對(duì)白術(shù)幼芽四倍體誘導(dǎo)率的影響

從表2和表3可以看出，高壓和抽濾滅菌的秋水仙素溶液處理的白術(shù)幼芽的存活率均存在隨著秋水仙素溶液濃度的升高而降低的趨勢(shì)。當(dāng)秋水仙素處理濃度為0.15%時(shí)，2種滅菌方式的四倍體誘導(dǎo)率均達(dá)最高，且抽濾滅菌秋水仙素溶液處理的四倍體誘導(dǎo)率比高壓滅菌秋水仙素溶液處理提高2.9%；2種滅菌方式的秋水仙素溶液處理幼芽，隨著處理時(shí)間加長(zhǎng)，毒害加重存活率逐漸降低，而誘導(dǎo)率則呈先逐漸升高隨后逐漸降低的趨勢(shì)。當(dāng)處理時(shí)間為16 h時(shí)，2種滅菌方式的誘導(dǎo)率均達(dá)最高，分別為7.83%和10.23%，抽濾滅菌明顯高于高壓滅菌。綜合考慮確定以抽濾滅菌為誘導(dǎo)白術(shù)四倍體的秋水仙素最佳滅菌方式，正交實(shí)驗(yàn)秋水仙素溶液誘導(dǎo)濃度選擇0.1%，0.15%，0.2%，處理時(shí)間選擇12 h，16 h，20 h。

圖1 二倍體試管植株與同源四倍體試管植株

表3 秋水仙素不同滅菌方式及處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)白術(shù)多倍體的影響

2.1.2抽濾滅菌秋水仙素溶液處理芽苗正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4結(jié)果可知，抽濾滅菌方式處理秋水仙素溶液后，秋水仙素的濃度為主要影響白術(shù)幼芽的存活率和四倍體誘導(dǎo)率的因素，處理時(shí)間次之；處理時(shí)間為影響白術(shù)幼芽變異率的主要因素。綜合分析存活率、變異率和四倍體誘導(dǎo)率結(jié)果，得到秋水仙素的濃度和處理時(shí)間的組合是X12X22，即秋水仙素處理濃度為0.15%，最佳處理時(shí)間16 h。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1白術(shù)二倍體與同源四倍體植株的形態(tài)特征比較

如圖1，觀察得出白術(shù)二倍體植株與同源四倍體植株在形態(tài)上表現(xiàn)出明顯的差異，白術(shù)二倍體植株苗小，葉片薄且小，葉色較淺，葉片鋸齒少；

白術(shù)四倍體植株莖粗，葉片大且厚，葉片褶皺，鋸齒多，呈深綠色，初步顯示出了四倍體植株巨型性的特征。

2.2.2二倍體和四倍體的氣孔大小和葉綠體數(shù)量

由表5可以看出，白術(shù)四倍體植株氣孔的縱徑、橫徑、面積分別為白術(shù)二倍體植株的1.4倍、1.6倍、2.2倍。二倍體植株的氣孔明顯比四倍體植株的小，但其氣孔分布多，白術(shù)二倍體植株葉片平均每視野氣孔個(gè)數(shù)是四倍體植株的2.3倍；白術(shù)四倍體植株葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目是二倍體的1.9倍。二者顯現(xiàn)出很明顯的差異，見圖2。

表4 抽濾滅菌秋水仙素溶液處理芽苗正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 不同植物激素配比對(duì)白術(shù)增殖的影響正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：a為二倍體染色體(10×100倍)；b為四倍體染色體(10×100倍)。圖3 白術(shù)試管植株染色體

注：a為二倍體葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體(10×100倍)；b為四倍體葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體(10×100倍)；c為二倍體葉片氣孔分布(10×10倍)；d為四倍體葉片氣孔分布(10×10倍)。 圖2 白術(shù)二倍體與同源四倍體試管植株葉片氣孔

表5 氣孔大小和葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)量

2.3 細(xì)胞學(xué)鑒定

在顯微鏡下觀察根尖制成的臨時(shí)裝片結(jié)果如圖3：白術(shù)二倍體植株的染色體條數(shù)為2 n=2 x=24，經(jīng)初步形態(tài)鑒定為四倍體的植株染色體條數(shù)為2 n=4 x=48。與程心旻等[9]的研究結(jié)果一致。

2.4 同源四倍體快繁體系的建立

預(yù)實(shí)驗(yàn)中接種在不同激素的MS培養(yǎng)基上的芽苗培養(yǎng)20 d后，發(fā)現(xiàn)其增殖率不同，6-BA濃度低于0.5 mg·L-1或者NAA濃度低于0.1 mg·L-1時(shí)增殖效果差，且增殖苗比較弱小，而6-BA濃度高于2 mg·L-1時(shí)增殖率反而降低，由此可見6-BA和NAA的濃度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)使白術(shù)的增殖率受影響。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表6)看出，白術(shù)試管苗的增殖培養(yǎng)，6-BA的影響最大，其次是NAA，IBA的作用較弱。綜合分析增殖芽數(shù)和增殖系數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得到最佳增殖培養(yǎng)基激素組合是6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.6 mg·L-1。白術(shù)試管苗在此培養(yǎng)基上增殖倍數(shù)最大，芽苗長(zhǎng)勢(shì)良好，增殖效果最佳，可以此指標(biāo)建立同源四倍體快繁體系。

3 小結(jié)與討論

喬永剛等[10]和王朝梁等[11]發(fā)現(xiàn)，黨參和三七加倍后出現(xiàn)葉片變大、變厚、葉色加深等特性。本實(shí)驗(yàn)中獲得的同源四倍體白術(shù)試管植株也有類似特征，白術(shù)同源四倍體試管植株的形態(tài)特征與二倍體植株存在明顯的差異；白術(shù)同源四倍體試管植株葉片的氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)量和面積與二倍體相比存在顯著的差別；染色體鑒定結(jié)果白術(shù)二倍體植株的染色體數(shù)為2 n=2 x=24，四倍體植株染色體為2 n=4 x=48。

對(duì)誘變的多倍體進(jìn)行倍性鑒定是獲得四倍體的重要環(huán)節(jié)。形態(tài)特征鑒定只能是作為初步確定，必須結(jié)合染色體計(jì)數(shù)才能作為真實(shí)倍性的確定依據(jù)。目前較為流行的流式細(xì)胞儀倍性鑒定技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速，可減少細(xì)胞學(xué)鑒定的工作量，但存在一定的假陽(yáng)性，且費(fèi)用較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合試管植株的形態(tài)、氣孔特征、染色體數(shù)量等3個(gè)方面對(duì)白術(shù)四倍體進(jìn)行了鑒定，染色體倍數(shù)鑒定仍采用傳統(tǒng)的壓片法。

秋水仙素是一種被廣泛應(yīng)用的動(dòng)植物多倍體誘導(dǎo)劑，對(duì)于植物微管蛋白的親合性要低于對(duì)動(dòng)物微管蛋白的親合性[12]。本研究雖較成功地獲得了秋水仙素誘導(dǎo)白術(shù)同源四倍體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但仍希望進(jìn)一步探尋一些更適合白術(shù)同源四倍體誘導(dǎo)的多倍體誘導(dǎo)程度高、用量少、藥害輕的誘導(dǎo)劑，如某些除草劑、微管抑制劑等，以提升白術(shù)同源四倍體的誘導(dǎo)效益。