(河南科技學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

種子是作物生產(chǎn)的基本材料，種子質(zhì)量是影響作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[1-3]。種子活力是反映種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，大田生產(chǎn)中，高活力種子能夠快速均勻出苗且苗齊苗壯，為高產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。低活力種子出苗速度慢且苗不齊，易造成減產(chǎn)[4,5]。

種子活力受外部和內(nèi)部因素雙重影響，其中內(nèi)源激素能影響多種信號(hào)途徑調(diào)控種子內(nèi)部的生理變化，是影響種子萌發(fā)及種子活力的關(guān)鍵因素。赤霉素(GA3)能夠打破休眠，提高種子內(nèi)源生長素(IAA)含量，進(jìn)而誘導(dǎo)降解乳糖、葡萄糖纖維素二糖等催化酶活性升高，加快糖的分解，促進(jìn)胚的分化，進(jìn)而促進(jìn)種胚萌發(fā)和發(fā)芽，而脫落酸(ABA)能夠抑制與貯藏物質(zhì)代謝有關(guān)的酶活性，從而限制種子萌發(fā)，負(fù)向調(diào)控種子活力[6-9]。低濃度IAA促進(jìn)種子萌發(fā)，提高種子活力，高濃度則抑制萌發(fā)，且不同植物種子對(duì)IAA濃度的敏感性不同[10,11]。細(xì)胞分裂素(CTKS)對(duì)ABA具有拮抗作用，可以解除ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制[12]。馮燕菇等研究表明，3個(gè)高活力小麥種子GA3/ABA的比值均顯著高于3個(gè)低活力品種，認(rèn)為GA3含量和GA3/ABA比值是影響種子萌發(fā)的重要因素[13]。王永飛等研究表明，在高溫條件下，ABA低于正常水平，而細(xì)胞分裂素則超過正常水平，在這種情況下，抑制劑/細(xì)胞分裂素比值將達(dá)到解除休眠的有效水平從而打破休眠，加速種子萌發(fā)，提高發(fā)芽指數(shù)[14]。因此，在種子萌發(fā)過程中，激素發(fā)揮重要作用，對(duì)種子萌發(fā)和發(fā)芽過程中的激素變化進(jìn)行深入研究，了解種子發(fā)芽過程中不同時(shí)期激素含量的變化將為種子活力的解析提供幫助。

小麥?zhǔn)俏覈谌蠹Z食作物，2017年全國小麥種植面積約為0.24億hm2，雜交小麥較普通小麥具有較高的增產(chǎn)潛力，其種子活力強(qiáng)弱直接關(guān)系到用種量及最終產(chǎn)量，激素是影響種子活力的關(guān)鍵因素，對(duì)其種子發(fā)芽過程中的激素變化進(jìn)行深入研究，有助于理解激素在雜交小麥種子活力及幼苗發(fā)育中的調(diào)控作用，為雜交小麥推廣提供幫助。本研究以河南科技學(xué)院新選育的2個(gè)雜交小麥和2個(gè)普通小麥種子為研究對(duì)象，檢測(cè)了發(fā)芽72 h內(nèi)源激素水平，考察了4個(gè)品種的種子活力，為揭示種子發(fā)芽不同階段內(nèi)源激素水平與種子活力的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為百農(nóng)矮抗58、周麥18、雜交小麥BN 666(BNS 366/0567)、雜交小麥665(BNS 366/矮05)，由河南科技學(xué)院小麥中心提供。

1.2 方 法

1.2.1激素測(cè)定

1) 儀器與試劑。

Agilent Technologies 1290 Infiniity Ⅱ高效液相色譜儀，Agilent 1290系列泵，Agilent 1260可變波長檢測(cè)器，安捷倫液相色譜工作站，Cary 100紫外分光光度計(jì)，JA 2003型電子天平(上海市安亭電子儀器廠)，KQ 3200 E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器廠)，MIKRO 220 R低溫冷凍離心機(jī)，智能光照培養(yǎng)箱GTOP-1000 B(浙江托普儀器有限公司)。

生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、細(xì)胞分裂素(KT)、玉米素(ZT)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司，純度≥99%)，甲醇(色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，80%甲醇(色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，45%甲醇(色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，蒸餾水(發(fā)芽用)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，所有試劑在使用前均使用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2) 色譜條件。

Agilent C 18 ZORBAX反相色譜柱(150 mm×4，6 mm，5 μm，Agilent公司);采用切換波長法;以外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。流動(dòng)相A為甲醇，B為0.075%乙酸的水溶液，流速:0.5 mL·min-1;進(jìn)樣量：20 μL。檢測(cè)器波長設(shè)置為254 nm；柱溫35 ℃。

3) 樣品前處理。

樣品處理參照Chen等[15]、Cai等[16]的方法，并予以改進(jìn)和優(yōu)化。取適量種子于發(fā)芽盒中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，人工培養(yǎng)箱中20 ℃培養(yǎng)。分別于6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取樣，置于研缽中加液氮研磨成粉，精確稱取4 g，加入預(yù)冷的80%甲醇10 mL，放入4 ℃冰箱浸提18 h。將樣品在4 ℃條件下，6 000 r·min-1，離心10 min，取上清液置于50 mL離心管中。在殘?jiān)屑尤? mL預(yù)冷的80%甲醇，繼續(xù)浸提10 min之后，離心10 min，然后將2次上清液混合。用4 mL乙腈預(yù)沖洗C 18小柱(活化小柱)，加4 mL超純水中和小柱，將上清液過C 18小柱，之后加1 mL超純水沖洗，加2 mL 45%甲醇進(jìn)行洗脫。取1 mL洗脫液過0.45 μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

參照王萌等[17]標(biāo)準(zhǔn)液配制方法，將GA3、ABA、IAA、KT、ZT分別稀釋，并配制成GA371.4 μg·mL-1、ABA 2.24 μg·mL-1、IAA 4.40 μg·mL-1、KT 24.4 μg·mL-1、ZT 4.24 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取標(biāo)準(zhǔn)液1、2、5、10 μL依次進(jìn)樣，測(cè)量其峰面積，以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，5種激素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)列于表1，5種激素在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

根據(jù)張自陽等[18]的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，每個(gè)品種100粒種子，3個(gè)重復(fù)，20 ℃人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，每天記載發(fā)芽種子數(shù)，第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，發(fā)芽結(jié)束統(tǒng)計(jì)正常幼苗鮮重并計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。

表1 5種內(nèi)源激素的線性回歸方程

發(fā)芽勢(shì)(%)=(第4天發(fā)芽種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)；

活力指數(shù)(VI)=GI×S；

式中：Gt為當(dāng)天的發(fā)芽數(shù)，Dt為當(dāng)日天數(shù)，S為發(fā)芽結(jié)束時(shí)單株幼苗鮮重。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種種子活力分析

發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是反映種子活力的重要指標(biāo)，均與種子活力呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，雜交小麥發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著低于普通小麥，其中BZ 666和BZ 665發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)差異極顯著，發(fā)芽率和活力指數(shù)差異不顯著，百農(nóng)矮抗58和周麥18間，4個(gè)指標(biāo)差異不顯著。綜合來看，周麥18發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，而BZ 666的4個(gè)指標(biāo)均最低(表2)，說明4個(gè)品種間，周麥18活力最高，BZ 666活力最低。

表2 不同品種種子活力比較

2.2 發(fā)芽不同時(shí)期4種激素變化趨勢(shì)分析

為了分析種子發(fā)芽期間不同階段的內(nèi)源激素變化情況，檢測(cè)了種子發(fā)芽6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的內(nèi)源GA3、ZT、KT、IAA和ABA含量。從檢測(cè)情況看，GA3、ZT、KT在6～72 h內(nèi)均能檢測(cè)到，生長素僅在48～72 h能夠檢測(cè)到，而ABA則僅在個(gè)別品種的某一階段檢測(cè)到。除百農(nóng)矮抗58外，另外3個(gè)品種發(fā)芽6～48 h內(nèi)，GA3(圖1 A)、KT(圖1 B)和ZT(圖1 C)變化趨勢(shì)平穩(wěn)，48 h后呈上升趨勢(shì)，但KT的上升速度高于GA3和ZT(圖1 B)。萌發(fā)48 h后，4個(gè)品種IAA含量均上升。按雜交小麥和普通小麥分類，4種激素在種子發(fā)芽6～72 h內(nèi)，普通小麥ZT和IAA含量高于雜交小麥(圖1 C、D)，但48 h后，雜交小麥種子KT含量和上升速度高于普通小麥(圖1 B)。從單個(gè)品種看，普通小麥百農(nóng)矮抗58種子萌發(fā)后4種內(nèi)源激素的變化趨勢(shì)不同于其他3個(gè)品種，百農(nóng)矮抗58種子萌發(fā)后， 6～24 h內(nèi)GA3和ZT含量略下降，但24 h后含量上升(圖1 A、C)，48 h后，IAA含量上升速度較快(圖1 D)，而KT在6～72 h內(nèi)含量變化平穩(wěn)(圖1 B)。

表3 雜交小麥和普通小麥激素含量差異方差分析

2.3 4個(gè)品種不同時(shí)期激素含量的方差分析

由表3可知，每個(gè)時(shí)期的KT和IAA含量差異均顯著，尤其是BZ 665與百農(nóng)矮抗58間，差異均達(dá)極顯著水平；雜交小麥與百農(nóng)矮抗58間，每個(gè)時(shí)期ZT含量均達(dá)顯著或極顯著水平，但雜交小麥與周麥18間僅個(gè)別時(shí)期差異顯著；24～72 h，雜交小麥與百農(nóng)矮抗58間，GA3含量差異均達(dá)極顯著，而雜交小麥與周麥18間僅個(gè)別時(shí)期差異顯著。雜交小麥間以及普通小麥間，個(gè)別時(shí)期的4種激素含量差異也達(dá)顯著或極顯著差異。

2.4 不同時(shí)期內(nèi)源激素與種子活力的相關(guān)性分析

由表4可知，發(fā)芽24 h、48 h的GA3含量與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)顯著相關(guān)；發(fā)芽6～72 h的ZT含量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)顯著或極顯著相關(guān)；發(fā)芽48～72 h的IAA與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)顯著或極顯著相關(guān)；發(fā)芽72 h的KT與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、活力指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)，而6～48 h的與相關(guān)指標(biāo)未檢測(cè)到相關(guān)關(guān)系。

表4 不同時(shí)期內(nèi)源激素與種子活力的相關(guān)性分析

3 討 論

種子活力是小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。與普通小麥相比，雜交小麥具有較強(qiáng)的生長優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在植株高大，穗多粒多，千粒重高[19]，但雜交小麥與普通小麥種子活力孰優(yōu)孰劣尚缺乏系統(tǒng)性研究。張自陽等[20]認(rèn)為，在老化程度一樣的情況下，雜交小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均高于其它4個(gè)常規(guī)品種，說明雜交小麥的抗老化能力較強(qiáng)。本研究中雜交小麥發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著低于普通小麥，這與張自陽等[19]研究結(jié)果不一致，可能與實(shí)驗(yàn)所用雜交小麥組合來源不同有關(guān)。雜交小麥千粒重較高，但灌漿不充分可能也是影響其種子活力的一個(gè)因素。

激素是影響種子活力的重要因素[21,22]。GA3、IAA及細(xì)胞分裂素對(duì)種子活力具有正調(diào)控作用，而脫落酸則負(fù)調(diào)控種子活力。本研究中，發(fā)芽24～48 h的GA3、6～72 h的ZT、48～72 h的IAA均與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)顯著或極顯著相關(guān)，與前人研究結(jié)果一致[13,-14]，但發(fā)芽6～12 h的GA3含量以及6～48 h的KT含量與種子活力沒有相關(guān)性，表明發(fā)芽不同時(shí)期的GA3素和KT對(duì)種子活力的影響程度不同。KT是一種細(xì)胞分裂素，發(fā)芽后72 h其含量與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)，說明不同的細(xì)胞分裂素對(duì)種子活力的調(diào)控作用有差異。發(fā)芽48 h后，雜交小麥種子KT含量及上升速度均高于普通小麥，而雜交小麥種子活力低于普通小麥，提示KT可能負(fù)向調(diào)控種子活力。

本研究對(duì)雜交小麥和普通小麥種子活力及發(fā)芽不同時(shí)期的GA3、KT、ZT、IAA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽不同時(shí)期，激素與種子活力的相關(guān)性差異較大。激動(dòng)素與種子活力各指標(biāo)負(fù)相關(guān)，且在雜交小麥中增加較快，提示其可能是雜交小麥種子活力低的一個(gè)因素，研究結(jié)果為理解種子發(fā)芽期的激素生理基礎(chǔ)及雜交小麥種子活力遺傳改良提供了可能。種子活力的維持是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，只有從激素調(diào)控、核酸修復(fù)、代謝水平和環(huán)境影響等各方面進(jìn)行綜合系統(tǒng)的研究，才能真正回答種子活力的本質(zhì)。雜交小麥由于雜種優(yōu)勢(shì)的存在，其種子活力的生理基礎(chǔ)更復(fù)雜，對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入的研究對(duì)農(nóng)業(yè)和糧食安全具有重要的意義。