蒙麗瓊 李晨曦 梁任佳 李學(xué)勁 馮光毅

摘 要：目的：評定高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法檢測南美白蝦中呋喃唑酮代謝物（AOZ）殘留量的不確定度。方法：通過分析不確定來源并計(jì)算合成不確定度，最終得到南美白蝦中呋喃唑酮代謝物的擴(kuò)展不確定度。結(jié)果：當(dāng)南美白蝦中呋喃唑酮代謝物含量為1.93 μg·kg-1時(shí)，在95%的置信區(qū)間下，擴(kuò)展不確定度為0.21 μg·kg-1（k=2）。

結(jié)論：實(shí)驗(yàn)過程的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法;南美白蝦;呋喃唑酮代謝物;不確定度

Abstract：Objective： To evaluate the uncertainty for the determination of AOZ residue in vannamei shrimp by HPLC-MS. Method： the sources of uncertainty that may be introduced were analyzed and each component of uncertainty was quantified and used to calculate combined uncertainty，and get the expanded uncertainty of AOZ residue in vannamei shrimp. Results： When the total content of? AOZ residue in vannamei shrimp was 1.93μg·kg-1， the expanded uncertainty was

0.21 μg·kg-1 （k=2） at a 95% confidence interval.? ?Conclusion： The preparation of standard solution， calibration curve fitting and measurement repeatability were the main sources of uncertainty.

Key words：HPLC-MS; Vannamei shrimp; AOZ; Uncertainty

中圖分類號：S948

硝基呋喃類抗生素是具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的人工合成廣譜抗菌藥物，硝基呋喃類物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)迅速分解，原藥穩(wěn)定性只有數(shù)小時(shí)，呋喃唑酮是硝基呋喃的一種，其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝物是3-氨基-2惡唑烷基酮（AOZ）。硝基呋喃類代謝物具有細(xì)胞誘導(dǎo)性、動(dòng)物致癌性[1-2]。歐盟1993年將呋喃唑酮禁用于食源性動(dòng)物，我國也于2002年本部禁用硝基呋喃類抗生素的禁令。在農(nóng)業(yè)部193號公告中，硝基呋喃類抗生素在所有食品動(dòng)物和所有用途中都被禁止使用[3-4]。然而，顯著的臨床治療效果和促生長作用，以及廉價(jià)易得的特點(diǎn)，使其仍然存在違法使用現(xiàn)象[5]。因此，動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類代謝物的檢測及其不確定的評定具有非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法》（GB/T 21311-2007）評定南美白蝦中呋喃唑酮代謝（AOZ）檢測的不確定度。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）、甲酸（HPLC）、乙酸乙酯（AR）、正己烷（AR）、鹽酸（AR）。

呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、同位素內(nèi)標(biāo)氘代呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，來源于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

1.2 儀器和設(shè)備

安捷倫6460C列安捷倫液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ESI源）;分析天平：SECURA225D-1CN型，檢定允許誤差為±0.000 05 g;電子天平：JJ1000/0.01 g～1 000 g，

允差±0.05 g。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取純2.00 g按照國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法》（GB/T 21311-2007）進(jìn)行樣品處理，過濾膜后，LC-MS/MS檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.2 色譜條件

Plus C18色譜柱（4.6×100 mm，1.8 μm）;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為10 mmol·L-1乙酸銨水溶液（pH=4.0）。梯度洗脫：

0～3 min時(shí)，20%B→40%B，3～6 min時(shí)，40%B，

6.01 min時(shí)，20%B;流速0.6 mL·min-1。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI（+）;掃描模式：MRM;干燥氣：溫度300 ℃，壓力45 psi，流速9 L·min-1;鞘氣溫度：250 ℃;鞘氣流速：11 L·min-1，毛細(xì)管電壓：4 000 V;定量離子：AOZ為236/134.1，AOZ-D4為240/134;定性離子對：AOZ為236/104。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

試樣中待測組分含量為：

（1）

式（1）中，X-樣品中待測物的濃度，單位為

μg·kg-1;C-樣液中標(biāo)準(zhǔn)工作曲線所校得到的待測物濃度，單位為μg·L-1;V-樣品定容液的體積，單位為mL;m-樣品質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來源分析

試樣中呋喃唑酮代謝物殘留量的不確定度的主要來源有樣品質(zhì)量稱量、體積、被測物質(zhì)量濃度、測量重復(fù)性和回收率。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品稱量的不確定度u（m）

稱取2 g南美白蝦樣品，天平最大允許誤差為±0.01 g，按照矩形分布s計(jì)算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（m）和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）分別為：

2.2.2 體積產(chǎn)生的不確定度u（V）

樣品濃縮后，用2 mL分度吸量管移取2 mL0.1%甲酸水溶解蒸殘物。2 mL分度吸量管體積允許誤差為±0.012 mL，按照均勻分布計(jì)算，其不確定度為：

溫度的變化范圍為（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)

β膨脹水為0.001 80 ℃-1，溫度變化引起水的體積變化，按照均勻分布計(jì)算，產(chǎn)生的不確定度為：

則定容時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）

2.2.3 被測物的質(zhì)量濃度產(chǎn)生的不確定度u（C）

C的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制、儲備液的稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合而得。

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的不確定度u（C-1）。呋喃唑酮代謝物（AOZ）標(biāo)準(zhǔn)值100 μg·mL-1，擴(kuò)展不確定度為0.10 μg·mL-1，k=2;呋喃唑酮代謝物-D4溶液標(biāo)準(zhǔn)值50 μg·mL-1，擴(kuò)展不確定度為3 μg·mL-1，k=2。使用1 mL移液器移取1 mL呋喃唑酮代謝物（AOZ）至10 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成

10 μg·mL-1的AOZ儲備液，使用1 mL移液器移取1 mL呋喃唑酮代謝物-D4溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)至50 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成1 μg·mL-1的AOZ-D4儲備液。

呋喃唑酮代謝物（AOZ）標(biāo)準(zhǔn)品和呋喃唑酮代謝物-D4溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋產(chǎn)生的不確定度u（C-2）。用

1 mL單標(biāo)線吸量管移取儲備液1 mL于10 mL容量瓶（A級）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，得到10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1∶10稀釋）。按照均勻分布處理，玻璃器具及溫度波動(dòng)引入的不確定度見表1。

則由AOZ儲備液由100 μg·mL-1稀釋到

10 μg·mL-1過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同理，再逐級稀釋到100 ng·mL-1，則得到AOZ儲備液稀釋過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則由AOZ-D4儲備液由50 μg·mL-1稀釋到

1 μg·mL-1過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同理，再逐級稀釋到100 ng·mL-1，則得到AOZ-D4儲備液稀釋過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程產(chǎn)生的不確定度u（C-3）。

使用20、100、200 μL移液器分別移取適量的

100 ng·mL-1 A0Z標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白南美白蝦基質(zhì)中，按照樣品處理，最終用2 mL單標(biāo)移液管加入2 mL 0.1%甲酸水定溶液，得到質(zhì)量濃度分別為標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。移液器的刻度誤差參考《移液器檢定規(guī)程》

（JJG 646-2006）的要求，按A類評定，如表2所示。2 mL單標(biāo)移液管的不確定度見（2）urel（V）=0.006 0。

則標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度u（C-4）。將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣3次，以峰面積（Ai）與內(nèi)標(biāo)峰面積（As）之比為縱坐標(biāo)yi，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（Ci）與內(nèi)標(biāo)濃度（Cs）之比為橫坐標(biāo)xi，采用最小二乘法擬合而成的線性回歸方程為yi=axi+b，測定數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果見表3。取一陽性樣品，對各待測化合物濃度C0進(jìn)行3次重復(fù)測定，其待測物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比的平均值為0.971，則由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度按（3）式計(jì)算：

（3）

式（3）中，SR-標(biāo)準(zhǔn)溶液待測物峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)

差;a-斜率;b-截距;p-對樣品溶液C0的測定次數(shù)3;

n-標(biāo)準(zhǔn)溶液測試次數(shù)，n=5×3=15;x0-校準(zhǔn)方程求得的陽性樣品溶液中待測物的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比;x-標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比的平均值，結(jié)果見表4。

2.2.4 測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u（X）

在空白試樣中添加2 μg·kg-1的呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定10次。重復(fù)測定的結(jié)果如表5所示，其中呋喃唑酮代謝物平均含量為1.94 μg·kg-1。

測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度為：

2.2.5 回收率產(chǎn)生的不確定度u（R）

在空白試樣中添加2 μg·kg-1的呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定10次。重復(fù)測定的結(jié)果回收率如表5所示。

回收率產(chǎn)生的不確定度為：

2.3 合成不確定度

由公式計(jì)算可得呋喃唑酮代謝物的合成不確定

度為：

2.4 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

依據(jù)JJF 1135—2005，呋喃唑酮代謝物含量的擴(kuò)展不確定度U（X）=urel（X）×X×2為0.21 μg·kg-1，故液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定南美白蝦中的呋喃唑酮代謝物含量的結(jié)果（1.93±0.21）μg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度最大，其次為回收率、測量重復(fù)性的影響。在檢測過程中，可通過嚴(yán)謹(jǐn)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，增加平行樣品測定次數(shù)，提高檢測人員的操作數(shù)練程度，可以降低不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

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