牟美睿，王聿雙，劉海學，楊仁杰

(1.天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院，天津 300384；2.天津農(nóng)學院 工程技術學院，天津 300384)

向日葵富含蛋白質及礦質營養(yǎng)元素，是世界重要油料作物之一[1]，具有較強的低溫、干旱耐受性[2]及自我修復能力[3]。在中國西北地區(qū)隨著鉛鋅礦產(chǎn)的開采，周邊環(huán)境中重金屬污染也成為亟待解決的問題[4]。重金屬鉛作為作物生長過程中的一種非必須元素[5]，不僅會影響作物的生長發(fā)育[6]，還會引起生理生化[7]和分子水平[8]的變化，對作物產(chǎn)生毒害作用[9]，最終通過食物鏈進入人體危害健康。

礦質元素與蛋白質廣泛參與植物體的各項生命活動[10]，也是決定作物品質的重要指標[11]。除受遺傳基因的調控，生長環(huán)境條件也影響作物吸收礦質元素[12]和蛋白質結構[13]，其中重金屬對作物的毒害作用在生理生化方面表現(xiàn)為增加氨基酸濃度[14]對蛋白質產(chǎn)生毒害作用[15]，引起膜脂過氧化導致小分子物質外泄[16]，在分子水平上能直接與蛋白質結構中的巰基結合，導致分子構象改變[17]、酶變性失活[18]及必需元素缺乏[19-20]。

目前，重金屬對作物的影響已有研究，但對于礦質元素吸收及蛋白結構變化的綜合研究尚未見報道，因此，本試驗以3個向日葵品種幼苗(‘2603’‘HA89’和‘HA300’)為材料，運用光焰原子吸收光譜法(FASS)與傅里葉紅外光譜技術(FTIR)，對鉛脅迫后吸收礦質元素的變化和蛋白二級結構的穩(wěn)定性進行研究，分析向日葵吸收礦質元素及蛋白二級結構響應鉛脅迫的相關性，為進一步研究向日葵抗重金屬脅迫生理變化及蛋白分子結構變化提供參考，同時可為后續(xù)探明向日葵抗重金屬脅迫機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試向日葵(HelianthusannuusL.)種子為穩(wěn)定性良好、具有較強耐受性及適應性的自交系品種‘2603’‘HA89’和‘HA300’。

1.2 材料處理

挑選飽滿均勻的籽粒于純水中催芽8 h，播種在20 cm×20 cm的發(fā)芽盒中，每盒40粒種子，采用Hoagland營養(yǎng)液水培，31 d后采取樣品，期間生長溫度為(25±1)℃，相對濕度70%，光照強度100%，每24 h補充醋酸鉛溶液40 mL，光照 8 h。本試驗設5組醋酸鉛處理，質量濃度分別為0 (CK)、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1、800 mg·L-1，重復3次。

1.3 測定方法

向日葵幼苗礦質元素含量測定采用火焰原子吸收分光光度計法，參照張薇等[21]所用的硝酸-高氯酸法并加以改進。稱取1.0 g研磨后的向日葵樣品置于消解管中，加入25 mL硝酸-高氯酸(體積比4∶1)置于電爐上加熱消解趕酸，直到樣品近干時取下冷卻，后用體積分數(shù)為2%的鹽酸定容到50 mL容量瓶內(nèi)，同時做純水空白。蛋白二級結構測定采用傅里葉紅外光譜法測定，將鉛脅迫后的3個品種向日葵幼苗，置于烘箱中 (60 ℃, 10 h)，烘干后與溴化鉀按質量比1∶200混合研磨至粉末，壓片進行紅外光譜采集。采用FTIR200傅里葉紅外光譜儀衰減全反射法FTIR-ATR室溫下掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描累加次數(shù)為32次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office Excel 2016與Origin Pro 9.0軟件對金屬元素的數(shù)據(jù)進行處理與分析。使用Omnic 8.1軟件對蛋白二級結構酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)進行自解卷積且殘差(R2)均在0.97以上。

2 結果與分析

2.1 向日葵幼苗吸收Mg、Cu、Ca、Zn、Fe、K對鉛脅迫的響應

對向日葵3種幼苗體內(nèi)的礦質元素含量進行測定(圖1)，結果顯示品種‘2603’對Ca、Mg、Zn、Fe的吸收在低濃度脅迫時顯著增加，當鉛脅迫濃度大于400 mg·L-1后吸收量隨著濃度的增加逐漸減少，而Cu、K元素則在脅迫下吸收變?yōu)橐种?，品種‘HA89’除Zn元素含量在600 mg·L-1鉛脅迫下較對照組顯著增加(P<0.05)，其余元素均隨著鉛脅迫濃度的增加吸收量在0.05水平上呈顯著性減小，而品種‘HA300’經(jīng)鉛脅迫后，促進對Ca元素的吸收，抑制對K元素的吸收，對Mg元素的吸收表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制，對Cu元素的吸收表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制，抑制Zn元素的吸收，對Fe元素的吸收除400 mg·L-1的脅迫均起到促進作用。由此可見，鉛脅迫對向日葵幼苗體內(nèi)吸收礦質元素的影響存在品種間及元素間差異，品種‘2603’表現(xiàn)為對大部分礦質元素低濃度促進，‘HA89’表現(xiàn)為對全部礦質元素抑制吸收，而品種‘HA300’則沒有明顯規(guī)律。

圖1 不同質量濃度處理下的3種向日葵幼苗吸收礦質元素含量Fig.1 Absorption of mineral elements contents of three sunflower seedlings under treatments of different mass concentrations

2.2 向日葵幼苗蛋白二級結構對鉛脅迫的響應

根據(jù)鉛脅迫下3個品種向日葵幼苗蛋白二級結構的相對含量可知(圖2)，0～800 mg·L-1鉛脅迫后向日葵3個品種的幼苗蛋白二級結構均以β-折疊和β-轉角結構為主，且以β-折疊結構的相對含量最多。與CK相比，品種‘2603’幼苗在鉛脅迫后其蛋白二級結構中有序含量減少，這可能是在鉛脅迫后，破壞了蛋白二級結構中的氫鍵，分子間展開程度增加，使蛋白二級結構發(fā)生了變化，最終增加了無序結構的相對含量，使得其蛋白二級結構趨于松散。較CK而言，品種‘HA300’和‘HA89’在鉛脅迫后幼苗蛋白二級結構中β-折疊結構的相對含量均上升，而β-轉角結構的相對含量均下降。但二者的有序結構相對含量在200 mg·L-1、800 mg·L-1鉛脅迫后下降，且以800 mg·L-1鉛脅迫后的‘HA300’幼苗變化最明顯，減少了2.23%，表明此時這兩個品種幼苗蛋白二級結構較不穩(wěn)定，不利于幼苗生長；而400 mg·L-1、600 mg·L-1鉛脅迫后幼苗蛋白質分子間聚集程度增加，有序結構相對含量增加，且品種‘HA300’在400 mg·L-1鉛脅迫后增加最多，為2.23%；‘HA89’則在600 mg·L-1鉛脅迫后變化最明顯，增加了4.37%，表明此時這兩個品種幼苗能較好地抵抗鉛毒害，使其蛋白二級結構不受影響。

圖2 鉛脅迫下3個品種向日葵根蛋白二級結構含量Fig.2 Secondary structure content of sunflower root protein in three varieties under lead stress

2.3 向日葵幼苗吸收礦質元素與蛋白二級結構相關性

對向日葵礦質元素含量與蛋白二級結構中不同結構含量進行Pearson相關分析(表1)，在不同濃度鉛脅迫下，有序結構α-螺旋、β-折疊與大部分礦質元素呈負相關關系，其中α-螺旋在‘HA89’品種中與Ca元素相關系數(shù)為-0.9，與Fe元素相關系數(shù)為-0.93，呈顯著負相關(P<0. 05)，而蛋白二級結構中無序結構無規(guī)則卷曲與β-轉角與除Ca、Zn元素外其余礦質元素呈不顯著正相關關系，其中β-轉角與Ca、Zn元素相關系數(shù)分別為0.97、0.88。由此可見，在鉛脅迫下礦質元素增加的同時向日葵蛋白二級結構中的有序結構降低，蛋白質穩(wěn)定性下降。

表1 3個向日葵品種在不同濃度脅迫下吸收礦質元素與蛋白結構相關系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between mineral elements and protein structure of three sunflower varieties under stress of different concentrations

注Note:*P<0.05;**P<0.01.

3 討 論

在植物生長過程中，重金屬會導致植物體內(nèi)礦質元素失衡[22]與蛋白質含量變化[23]，同時植物在長期對環(huán)境的適應過程中，也會產(chǎn)生相應的防御機制，主要分為根部跨膜吸收[24]、木質部運輸[25]、金屬硫蛋白螯合作用[26]及轉運蛋白結合金屬離子[27]。其中，植物根部與木質部通過細胞壁中纖維素、木質素等物質與金屬離子結合方式，阻止其進入植物細胞產(chǎn)生毒害作用，但植物根部與木質部作為植物礦質營養(yǎng)吸收運輸?shù)闹匾鞴賉28]，在阻止重金屬離子進入細胞的同時也會阻止對礦質元素的吸收，同時由于其相似的化學性質或關聯(lián)的代謝途徑，植物中礦質元素與重金屬離子也存在相互作用和影響[12]，宋潔等[7]在研究低Pb、Cd積累馬鈴薯品種礦質營養(yǎng)元素相關性時也發(fā)現(xiàn)土壤中高Pb能抑制大豆對Ca、Cu、Fe、Mg和Zn的吸收。因此在一定程度上礦質元素吸收的增加意味著重金屬元素的積累[28]，因而植物對礦質元素的吸收可以反映重金屬防御機制的有效性。在本研究中，向日葵品種‘2603’對礦質元素的吸收隨鉛濃度的增加而增加，這與胡鐵柱等[29]的研究一致，說明該品種的細胞壁并未有效結合金屬離子起到防御作用；品種‘HA89’對礦質元素的吸收隨鉛濃度的增加表現(xiàn)為抑制，即植物在阻止重金屬離子進入細胞的同時也阻止了對礦質元素的運輸；品種‘HA300’對礦質元素的吸收隨鉛脅迫濃度的增加無規(guī)律性變化，這與包曙光等[30]的研究一致，這可能是由于該品種對重金屬脅迫的響應存在離子間差異。

而植物對重金屬的防御機制中的螯合作用與轉運蛋白則是通過金屬硫蛋白(MT) 、HMAs轉運蛋白等蛋白質與重金屬離子結合貯存在液泡中排出體外，從而緩解重金屬對植物的毒害作用，同時植物體內(nèi)的蛋白質可以發(fā)揮不同的作用是由于其功能特性[31]，蛋白質的功能性又取決于結構的穩(wěn)定性，因此蛋白二級結構可有效反應植物對重金屬脅迫的抵御能力[32]，同時龔寧等[33]發(fā)現(xiàn)蛋白二級結構的穩(wěn)定性是作物抵御重金屬毒害的重要原因，而史洲銘等[34]也在研究中發(fā)現(xiàn)，無序結構含量多可能是造成其重金屬含量偏低的因素，在本研究中，向日葵品種‘2603’蛋白二級結構中無序結構相對含量增加，蛋白質功能性遭到破壞，從而導致部分蛋白無法發(fā)揮作用，破壞防御機制；而品種‘HA89’蛋白質中有序結構相對含量增加，說明該品種中蛋白質結構穩(wěn)定性增加，抵御重金屬脅迫的能力較強。

在本研究對3個品種向日葵幼苗礦質元素吸收量與蛋白二級結構相對含量間的關系進行了相關性分析得出，向日葵幼苗中對礦質元素的吸收量與蛋白二級結構中有序結構的相對含量呈不顯著負相關關系，同時，礦質元素的吸收量與蛋白二級結構中無序結構相對含量呈不顯著正相關，這可解釋為向日葵幼苗在響應重金屬脅迫時抵御機制發(fā)揮的作用具有一致性，這與的機制研究結論相似[35]，但該論斷是否合理仍有待進一步研究。

4 結 論

本研究在不同濃度鉛脅迫下對向日葵吸收礦質元素及蛋白二級結構變化進行了研究，結果表明：向日葵抵御重金屬脅迫存在品種間差異，隨著鉛脅迫濃度的增加，品種‘2603’對礦質元素的吸收增加，蛋白二級結構的穩(wěn)定性降低，品種‘HA89’對礦質元素的吸收受到抑制，蛋白二級結構趨于穩(wěn)定，品種‘HA300’對礦質元素的吸收無明顯規(guī)律，同時在對向日葵幼苗吸收礦質元素與蛋白二級結構響應鉛脅迫的相關性研究中發(fā)現(xiàn)，3種向日葵幼苗在鉛脅迫下對礦質元素的吸收與蛋白二級結構的穩(wěn)定性均存在負相關但不 顯著。