楊亦文，陳穎熙，蔡影峰，邢斯程，吳芮庭，陳凝雪，廖新俤，2，3*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，廣州510642）

豬場廢水處理系統(tǒng)是抗生素抗性基因的重要儲存庫，其最高絕對豐度達到108copies·mL-1，相對豐度達到10-1copies·16S rRNA-1[1-2]。豬場廢水中的抗性基因由不同耐藥類型的抗性基因亞類組成。Jia等[3]在豬場廢水中檢測到196 種抗性基因，包括常見四環(huán)素類、氨基糖苷類、磺胺類、多重耐藥類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、甲氧芐啶、鏈霉素、多黏菌素和萬古霉素等的14 大類抗性基因。廢水中不同類型的抗性基因存在于菌群中，賦予菌群抵御不同類型抗生素的能力，甚至存在于作物病原菌和人類致病菌中，增加耐藥性的污染風(fēng)險。然而，研究表明豬場廢水處理系統(tǒng)并不能完全去除廢水中的抗性基因，其系統(tǒng)出水中仍能檢測到102～106copies·mL-1的抗性基因[2，4]。系統(tǒng)出水中殘留的抗性基因及耐藥菌會隨著出水被重復(fù)利用或外排進入到環(huán)境中，對豬場及周邊環(huán)境造成更廣泛的污染，威脅養(yǎng)殖生產(chǎn)及公共健康。

廢水中的總抗性基因包括細菌胞內(nèi)抗性基因和胞外抗性基因[5-6]。目前大部分的研究側(cè)重細菌胞內(nèi)抗性基因，缺少對胞外抗性基因的研究。胞外抗性基因包括廢水中游離的抗性基因及噬菌體所攜帶的抗性基因。水體中游離的抗性基因是指游離的核酸片段，存在形態(tài)不穩(wěn)定，容易受pH、溫度和重金屬等環(huán)境因子的影響[7]，并且只有融入到細菌中才能發(fā)揮其耐藥功能。噬菌體是細菌之間基因水平轉(zhuǎn)移的主要載體，可從感染細菌中攝取抗性基因，是廢水中抗性基因的小型儲存庫[8-9]。在噬菌體感染下一個細菌時，其攜帶的抗性基因可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式傳播到其他細菌中，實現(xiàn)抗性基因在不同細菌間的水平轉(zhuǎn)移，增加環(huán)境抗性基因污染的復(fù)雜性。因此，環(huán)境中噬菌體攜帶抗性基因的污染現(xiàn)狀受到廣泛關(guān)注，在畜禽糞便、農(nóng)田土壤和城市污水等環(huán)境均檢測到高豐度的噬菌體攜帶抗性基因。豬場廢水處理系統(tǒng)出水是周邊環(huán)境重要的潛在污染源之一。然而，目前鮮有關(guān)于豬場廢水處理系統(tǒng)出水及周邊環(huán)境中噬菌體攜帶抗性基因的報道。

基于此，本研究選擇5 個典型豬場廢水處理系統(tǒng)為研究對象，采集其出水樣及排入河流上下游水樣，檢測9 種抗性基因及2 種整合子基因的豐度，分析其在不同豬場出水及周邊河流中的污染特征，初步探討豬場廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因?qū)χ苓吅恿鳝h(huán)境的影響，為評估養(yǎng)豬場抗性基因污染風(fēng)險提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣豬場

選擇位于江西省境內(nèi)的5 個規(guī)?；i場的廢水處理系統(tǒng)，采集其系統(tǒng)出水及排入河流上、下游水樣。共采集5 個種豬場，編號分別為A、B、C、D、E，其養(yǎng)殖規(guī)模分別為5 500、3 500、6 000、9 000、16 000頭（存欄母豬），均采用厭養(yǎng)+兩級A/O（缺氧、好氧工藝）+加藥混凝、消毒廢水處理系統(tǒng)。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器：普通PCR 儀（BIO-RAD，T100，美國）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon，2500，中國）、實時熒光定量PCR 儀（BIO-RAD，CFX96，美國）、循環(huán)水真空泵[瑞德，SHZ-D（Ⅲ），中國]、臺式高速冷凍離心機（Micro 17R，Thermo Scientific，美國）、微量紫外分光光度計（Nano Drop，2000，Thermo Scientific，美國）和-80 ℃超低溫冰箱（Haier，DW-86L626，中國）。

主要試劑：SYBR Green 熒光定量檢測試劑盒（TIANGEN，F(xiàn)P209，中國）、pMD18-T Vector（Takara，日本）、DH5α 感受態(tài)細胞（TIANGEN，CB101，中國）、噬菌體DNA 提取試劑盒（TIANGEN，TIANamp Virus DNA/RNA Kit，中國）、質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA，Plasmid Mini Kit，美國）、超強高保真PCR 試劑盒（TIANGEN，KP203，中國）。

1.3 試驗方法

1.3.1 水樣采集及預(yù)處理

采集5 個典型豬場廢水處理系統(tǒng)的出水樣、排入河流的上游200 m 處水樣和下游200 m 處水樣，每一個采樣點同時采集3 個樣品作為3 個重復(fù)；每個重復(fù)樣采集相隔1 m，采集水面10 cm 處水樣，每個樣4 L。所有樣品用冰覆蓋運輸，當日到達實驗室進行預(yù)處理。用0.22 μm 孔徑低蛋白結(jié)合濾膜去除水樣中的細菌，獲得含有噬菌體的濾液，并用100 kDaAmicon Ultra 離心過濾器（Millipore）濾去游離的核酸，并將濾液濃縮至1 mL（濃縮500倍）。含噬菌體的濃縮樣于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 檢測指標及方法

提取樣品噬菌體中的DNA，檢測3種四環(huán)素類抗性基因（tetG、tetX和tetW）、2種磺胺類抗性基因（sul1和sul2）、2種大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因（ermA和ermB）、1種β-內(nèi)酰胺類抗性基因（blaTEM）、1 種氯霉素類抗性基因（cmlA）和2個整合子基因（intl1和intl2）的絕對豐度。

（1）噬菌體DNA提?。喊凑帐删wDNA提取試劑盒（TIANGEN，TIANamp Virus DNA/RNA Kit，中國）提供的說明書提取樣品中的噬菌體DNA，用超微量分光光度計測定所提取DNA 樣品的濃度及D260/280，經(jīng)1%凝膠電泳分析所提DNA 樣品的質(zhì)量，并用16S rRNA 通用引物對所提DNA 樣品進行定性，確保所提噬菌體DNA樣品不含細菌DNA。

（2）建立熒光定量PCR 標準曲線：參考本團隊之前研究構(gòu)建的qPCR 標準曲線[10]。主要步驟如下：利用抗性基因特異性引物（表1）對樣品進行普通PCR，通過凝膠電泳獲得特異性條帶。將確認后的特異性條帶進行回收純化，構(gòu)建于pMD180T 載體中，并轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞。菌液擴繁，提取菌液質(zhì)粒進行10 倍稀釋，獲得以質(zhì)粒為模板的熒光定量標準曲線。標準曲線的拷貝數(shù)（copies）=L×C/（N×M×109），其中L為阿弗加德羅常數(shù)（6.02×1023），C是質(zhì)粒DNA濃度，N為目的DNA 模板長度（目的基因長度+2 992 bp），M為每對DNA的平均分子量（660）。

每個稀釋梯度設(shè)3 個重復(fù)進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.75 μL，ddH2O 10 mL，模板1 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，40 個循環(huán)，溶解曲線按默認程序。所有基因的標準曲線擴增效率在95%～105%，R2大于0.99。

表1 抗性基因及整合子PCR引物信息Table 1 PCR primer information of resistance genes and integrants

（3）樣品中抗性基因及可移動遺傳元件的檢測：采用建立好的標準曲線，以樣品噬菌體DNA 為模板，使用（2）的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個樣品3 個重復(fù)，檢測樣品噬菌體中抗性基因及可移動遺傳元件的拷貝數(shù)?？剐曰蚝涂梢苿舆z傳元件拷貝數(shù)（copies·mL-1）=標曲算出的拷貝數(shù)（copies·μL-1）×DNA 洗脫體積（μL）/樣品體積（mL），基因絕對豐度使用基因拷貝數(shù)（N）的以10為底的對數(shù)（lgN）表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

檢測數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 進行初步處理，GraphPad Prism 8.0 軟件作圖，SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析和相關(guān)性分析（Spearman），結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體攜帶抗性基因的檢出情況

對5 個典型豬場廢水處理系統(tǒng)出水及周邊河流上下游水樣中的9種噬菌體攜帶抗性基因和2種整合子基因進行普通PCR 定性檢測，結(jié)果如表2所示。所有樣品均檢測到抗性基因blaTEM、sul2、tetW和tetX；在豬場廢水處理系統(tǒng)出水中只有1/5（C 場）的采樣點檢測到抗性基因cmlA，2/5（B場和C場）的采樣點檢測到抗性基因sul1，而所有上下游樣品均檢測到cmlA和sul1；在系統(tǒng)出水中只有1/5（E 場）的采樣點檢測到抗性基因ermA，而有4/5 的上游河流采樣點和3/5 的下游河流采樣點檢測到ermA，表明豬場廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因檢測率低于周邊的河流樣，這也說明本研究中的豬場廢水處理系統(tǒng)出水不是周邊河流噬菌體攜帶抗性基因的主要污染來源。所有上游河流樣都檢測到抗性基因ermB和tetG，而在下游河流中只有4/5（除了B 場）的采樣點檢測到ermB和tetG；上游河流樣中有4/5 的采樣點檢測到抗性基因ermA，而下游只有3/5 的采樣點檢測到ermA，表明下游河流樣中的噬菌體攜帶抗性基因檢出率低于上游河流樣，也說明河流中的抗性基因等污染物可能通過河流自凈功能被消除[19]。此外，所有樣品噬菌體中都檢測到與基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的整合子基因intl1和intl2，這增加了系統(tǒng)出水和周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因污染的復(fù)雜性。

表2 不同采樣點中抗性基因及整合子基因的檢出情況Table 2 Detection of resistance genes and integron genes in different sampling sites

表3 樣品中抗性基因及整合基因絕對豐度Table 3 The logarithm of the copy number of resistance genes and integron genes in samples

2.2 噬菌體攜帶抗性基因的含量及其相關(guān)性

對所有樣品中的噬菌體攜帶抗性基因進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 個豬場廢水處理系統(tǒng)出水和周邊河流中含有較高豐度的噬菌體攜帶抗性基因（表3），其中磺胺類抗性基因sul2的平均豐度最高，高達4.09±0.16，顯著高于四環(huán)素類抗性基因tetX（3.24±0.19）和tetG（3.22±0.29）（P＜0.05）；tetX和tetG的絕對豐度顯著高于磺胺類抗性基因sul1（2.46±0.39）和四環(huán)素類抗性基因tetW（2.38±0.18）（P＜0.05）；sul1和tetW的絕對豐度與blaTEM（2.18±0.22）的豐度之間沒有顯著差異，顯著高于大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB（2.04±0.18）和氯霉素類抗性基因cmlA（1.93±0.34）（P＜0.05）；大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermA的平均絕對豐度最低，為1.05±0.28，顯著低于其他抗性基因（P＜0.05）。整合子基因intl1和intl2也被檢測含有較高的豐度，其平均豐度對數(shù)值分別為3.70±0.15和2.28±0.18。

對樣品中9種噬菌體攜帶抗性基因和2種整合子基因的豐度進行雙變量相關(guān)性分析，采用Spearman相關(guān)系數(shù)，雙尾檢驗，結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除基因tetW和blaTEM、intl2和ermB，以及intl2和tetW之間外，其余抗性基因之間均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），其中氯霉素抗性基因cmlA分別與β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaTEM和磺胺類抗性基因sul1之間存在強正相關(guān)（P＜0.05）；整合子基因intl1分別與抗性基因blaTEM、cmlA和sul1之間呈強正相關(guān)（P＜0.05）。以上結(jié)果表明豬場廢水處理系統(tǒng)出水及周邊河流中的噬菌體攜帶抗性基因及整合子基因之間存在共現(xiàn)模式。

2.3 不同豬場樣品中噬菌體攜帶抗性基因的絕對豐度

對不同豬場廢水處理系統(tǒng)出水樣和上下河流水樣中的噬菌體攜帶抗性基因豐度進行分析（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同豬場樣品中噬菌體攜帶抗性基因的豐度有較大差異。氯霉素抗性基因cmlA和磺胺類抗性基因sul1的豐度在各豬場之間沒有顯著差異（P＞0.05）；而β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaTEM在豬場E 的絕對豐度最高，為2.69±0.29，顯著高于其他豬場（P＜0.05）；磺胺類抗性基因sul2在豬場B（4.58±0.21）和C（4.50±0.16）中的豐度顯著高于其他豬場（P＜0.05）；大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB在豬場C（2.62±0.16）中的豐度顯著高于其他豬場（P＜0.05）；大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermA在豬場E中的豐度最高，為1.43±0.4；四環(huán)素類抗性基因tetG在豬場A 中的豐度最高，為3.62±0.34；tetW在豬場B（2.88±0.35）中的豐度最高；tetX在豬場E 中的豐度最高，為3.68±0.25。

2.4 豬場廢水處理系統(tǒng)出水和河流上下游水樣中噬菌體攜帶抗性基因的絕對豐度

對豬場廢水處理系統(tǒng)出水、河流上游和下游水樣中噬菌體攜帶抗性基因的豐度進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)出水中9 種抗性基因的總豐度（2.01±0.21）顯著低于河流上游（3.03±0.13）和下游（2.88±0.16）中總抗性基因的豐度（P＜0.05）（圖3），河流上游的總抗性基因豐度高于河流下游，但差異不顯著（P＞0.05）。其中，β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaTEM、氯霉素類抗性基因cmlA、磺胺類抗性基因sul1和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermA在系統(tǒng)出水中的絕對豐度分別為1.38±0.34、0.10±0.10、0.50±0.31 和0.26±0.26，顯著低于其在河流上下游中的豐度（P＜0.05）（圖4）；抗性基因sul2在河流上游中的豐度高于系統(tǒng)出水和河流下游中的豐度，但差異不顯著（P＞0.05）；其他噬菌體攜帶抗性基因在系統(tǒng)出水、河流上游和下游中的豐度沒有顯著差異。此外，整合子基因intl1和intl2基因在系統(tǒng)出水中的豐度顯著低于河流上游和下游中的豐度（P＜0.05）。綜上結(jié)果表明，豬場廢水系統(tǒng)出水中抗性基因的豐度顯著低于河流中抗性基因的豐度，這也進一步說明豬場廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶的抗性基因未對周邊河流造成顯著影響。

圖1 不同基因豐度之間相關(guān)性分析熱圖Figure 1 Heatmap of correlation analysis between different gene abundances

3 討論

豬場廢水處理系統(tǒng)是連接廢水和外界環(huán)境的重要橋梁，其出水中殘留的抗性基因直接影響周邊環(huán)境的安全。然而目前大部分的報道僅對系統(tǒng)出水中的細菌抗性基因進行了研究，缺少關(guān)于系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因的報道。研究表明，豬場廢水處理系統(tǒng)出水中仍能檢測到高豐度的細菌抗性基因，其檢出豐度高達105～106copies·mL-1[20-21]。本研究對5 個典型豬場廢水處理系統(tǒng)出水中的9 種噬菌體攜帶抗性基因進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因的平均豐度高達2.01±0.21，其中sul2和tetX平均豐度分別高達3.85±0.38 和3.24±0.28，說明豬場廢水處理系統(tǒng)不能完全去除廢水中的噬菌體攜帶抗性基因。此外，還檢測到高豐度的整合子基因intl1和intl2。整合子基因與細菌基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)，可把抗性基因等遺傳物質(zhì)整合到轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒等可移動遺傳因子上，實現(xiàn)抗性基因在不同細菌間的傳播[22]，進一步促進系統(tǒng)出水中抗性基因的水平轉(zhuǎn)移。系統(tǒng)出水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因和整合子基因增加了抗性基因防控的復(fù)雜性，也說明在關(guān)注細菌抗性基因污染的同時，也應(yīng)重視環(huán)境中噬菌體攜帶抗性基因污染問題。

圖2 不同豬場樣品噬菌體攜帶抗性基因的絕對豐度Figure 2 Absolute abundance of phage carrying resistance genes in samples from different farms

圖3 系統(tǒng)出水及河流上下游水樣中總抗性基因及整合子基因的豐度Figure 3 Abundance of total resistance genes and integron genes in the effluent of the system and the water samples of the upstream and downstream

圖4 系統(tǒng)出水及河流上下游樣品中不同噬菌體攜帶抗性基因的豐度Figure 4 Abundance of resistance genes carried by different bacteriophages in samples from the effluent，upstream and downstream

豬場廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的抗性基因會隨著出水外排進入周邊河流中，對周邊環(huán)境安全造成威脅。本研究在5 個豬場周邊河流的上下游樣品中均檢測到9 種噬菌體攜帶抗性基因，其中blaTEM、cmlA、sul1、sul2、tetW和tetX的檢出率是100%。在河流上游中噬菌體攜帶抗性基因的平均檢出豐度高于下游的檢測豐度，但差異不顯著（P＞0.05）。這說明河流本身有一定的自凈功能[19]，能一定程度上降低水體中殘留的噬菌體攜帶抗性基因。意外的是，研究發(fā)現(xiàn)豬場廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因的平均豐度遠低于河流上下游的平均豐度（P＜0.05），達到1 個數(shù)量級的差異，表明豬場廢水處理系統(tǒng)出水不是周邊河流噬菌體攜帶抗性基因的主要污染源。前期研究也表明，豬場廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的細菌抗性基因豐度顯著低于周邊河流中的豐度（P＜0.05），未對周邊河流造成顯著影響[10]。目前，我國典型的豬場廢水處理系統(tǒng)末端都有深度處理工藝，系統(tǒng)出水在外排到外界環(huán)境之前會經(jīng)過化學(xué)物理等深度處理，雖然不能完全去除出水中殘留的抗性基因，但能殺死大部分的細菌及噬菌體等微生物，從而能有效減低出水中細菌及噬菌體攜帶抗性基因的豐度，降低了其對周邊環(huán)境安全的污染風(fēng)險[23-24]。但是個別噬菌體攜帶抗性基因，如ermB和tetW，在廢水處理系統(tǒng)出水中的豐度高于周邊河流中的豐度，對周邊環(huán)境的安全仍存在較大的威脅，需要加以重視。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同豬場廢水處理系統(tǒng)及周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因的分布特征具有顯著差異，如豬場E廢水處理系統(tǒng)的出水及周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因blaTEM的豐度顯著高于其他處理系統(tǒng)（P＜0.05），豬場C的出水及周邊河流中ermB的豐度顯著高于其他系統(tǒng)（P＜0.05），而豬場D 的出水及周邊河流中sul2的豐度顯著低于其他系統(tǒng)（P＜0.05）。影響抗性基因分布的因子很多，如抗生素、重金屬和消毒水等污染物[1，25]。不同豬場廢水處理系統(tǒng)及周邊河流中環(huán)境因子的不同導(dǎo)致其抗性基因分布的差異。在此需要特別注意的是，規(guī)?；i場和中小型豬場所使用的廢水處理設(shè)施與管理水平有一定的差異，可能會造成其出水的水質(zhì)及抗性基因殘留水平差異。本研究僅評估了規(guī)?；i場廢水處理系統(tǒng)出水對周邊河流的影響，中小型豬場廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因及對周邊環(huán)境的污染風(fēng)險需要進一步評估。以上結(jié)果說明，噬菌體攜帶抗性基因在不同處理系統(tǒng)及環(huán)境之間的污染差異增加了耐藥性防控的復(fù)雜性，需要針對不同抗性基因污染的環(huán)境設(shè)計不同的防控方案。

4 結(jié)論

（1）典型豬場廢水處理系統(tǒng)出水中常見噬菌體攜帶抗性基因污染普遍存在，表明豬場廢水處理系統(tǒng)未能完全去除廢水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因，進一步凸顯了豬場及周邊環(huán)境中抗性基因污染問題的嚴重性。

（2）豬場廢水處理系統(tǒng)周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因的檢測率及豐度顯著高于其廢水處理系統(tǒng)出水中的檢出率及豐度（P＜0.05），表明典型豬場廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因未對周邊河流造成顯著影響。