付宇童，孫彤，王林，徐應(yīng)明，梁學(xué)峰，孫約兵*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300191）

銅納米顆粒（Copper nanoparticles，Cu NPs）具有較高的導(dǎo)熱性、導(dǎo)電性及抗微生物特性，被廣泛應(yīng)用于陶瓷、抗菌劑、潤滑油和涂料等許多工業(yè)產(chǎn)品中[1]。在其生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用及處置過程中將不可避免地進(jìn)入土壤中，并被植物吸收進(jìn)入食物鏈，因此關(guān)注Cu NPs 釋放到環(huán)境中對生態(tài)系統(tǒng)及人類健康的潛在影響是十分必要的。李芳芳等[2]研究發(fā)現(xiàn)，粒徑為10～30 nm Cu 粉使肋骨條藻中葉綠素含量降低，0.1 mg·L-1Cu NPs 對肋骨條藻細(xì)胞生長抑制率達(dá)50%。范功端等[3]證明了0.3～1.3 mg·L-1Cu NPs 會顯著抑制斜生柵藻生長，降低葉綠素含量，2.0～3.3 mg·L-1Cu NPs 使斜生柵藻幾乎停止生長且出現(xiàn)細(xì)胞破裂現(xiàn)象。Lee等[4]觀察到Cu NPs對綠豆和小麥幼苗的生長造成負(fù)面影響，且綠豆比小麥更為敏感。Tamez等[5]研究表明，Cu NPs會抑制西葫蘆生長，200 mg·kg-1Cu NPs使植物根組織抗壞血酸酶活性降低80%。Zhang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)1 mg·L-1Cu NPs 會激發(fā)小麥體內(nèi)參與脯氨酸代謝的相關(guān)基因表達(dá)。Apodaca 等[7]發(fā)現(xiàn)50～100 mg·L-1Cu NPs 處理會改變食用豆?fàn)I養(yǎng)價值。上述研究表明，Cu NPs 對植物的影響因其本身性質(zhì)、濃度及植物物種等的不同，表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)各有差異。

小油菜（Brassica chinensisL.）是我國種植面積和范圍最廣的蔬菜品種之一，有關(guān)其對Cu NPs 毒性響應(yīng)的研究較少。本文選擇小油菜為研究對象，探究Cu NPs 對小油菜種子發(fā)芽率、根莖伸長情況，以及幼苗超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的影響，分析了Cu NPs 在小油菜幼苗體內(nèi)的吸收累積，利用透射電子顯微鏡觀察根部的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，以期為Cu NPs的安全評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小油菜種子購自廣州長合種子有限公司，發(fā)芽率為95%。Cu NPs 粒徑為10～30 nm，純度≥99.9%，比表面積為6.99 m2·g-1，利用透射電子顯微鏡（JEM-2010，日本）對Cu NPs進(jìn)行表征，見圖1。

圖1 Cu NPs透射電鏡圖Figure 1 Transmission electron microscope（TEM）of Cu NPs

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 Cu NPs懸浮液的制備

將Cu NPs 粉末加入超純水中，超聲（100 W，40 kHz）1 h，使Cu NPs 粉末可以均勻分散于超純水中形成懸浮溶液備用，將超聲后的懸浮液置于磁力攪拌器上攪拌，使之成為均勻的懸濁液[8]。

1.2.2 預(yù)試驗(yàn)

設(shè)置4 個Cu NPs 濃度梯度：0、2、20、200 mg·L-1，每個處理3 個重復(fù)，培養(yǎng)4 d 后，測量種子發(fā)芽數(shù)量（種子露白即被認(rèn)為發(fā)芽）、根長和莖長（以胚軸與根之間的過渡點(diǎn)區(qū)分根長和莖長），并計(jì)算Cu NPs 對種子根抑制率分別為10%和50%時的濃度值，即IC10和IC50[8]。

抑制率=（A-B）/A×100%

式中：A為對照組小油菜種子根伸長或莖伸長，cm；B為各濃度Cu NPs 處理下小油菜種子根伸長或莖伸長，cm。

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果以濃度-抑制率繪制曲線，進(jìn)行回歸分析，并根據(jù)回歸方程計(jì)算Cu NPs 對根伸長及莖伸長抑制率為10%和50%的濃度值，即IC10和IC50。

回歸方程依據(jù)y=A×ln（x）+B 或y=Cx3+D，其中A、B、C、D為曲線常數(shù)。

1.2.3 正式試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在Cu NPs 對小油菜根伸長抑制率10%～50%范圍內(nèi)，設(shè)置濃度為0、1、2、4、6、8 mg·L-1和10 mg·L-1，取各濃度的Cu NPs懸濁液6 mL 置于鋪有一層濾紙、內(nèi)徑為12 cm 的無菌培養(yǎng)皿中，每個處理均設(shè)8 個重復(fù)。分別接入小油菜種子各20 粒，蓋好培養(yǎng)皿，置于25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d[8]。暴露培養(yǎng)結(jié)束時，測定各處理組種子的發(fā)芽數(shù)量、根莖伸長量、根莖抑制率、Cu 含量、抗氧化酶活性以及根細(xì)胞微觀形態(tài)。

1.3 測定方法

選取小油菜幼苗根部鮮樣固定于2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）戊二醛固定液中，經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸緩沖液清洗，乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷置換，進(jìn)行樹脂浸透包埋，在烘箱中聚合。將包埋塊置于超薄切片機(jī)（Leica ultra?cut R，德國）上進(jìn)行切片，染色后通過透射電子顯微鏡（JEM-1230，日本）觀察并拍照[9]。

抗氧化酶活性的測定方法參考文獻(xiàn)[10]。稱取0.1 g 植物鮮樣加入50 mmol·L-1磷酸緩沖液冰上勻漿，4 ℃8 000g離心10 min，上清液即為粗酶液。POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT 活性測定采用高錳酸鉀滴定法，SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑光化還原法。

收集小油菜幼苗后，蒸餾水清洗3 遍，殺青，置于65 ℃下烘干至恒質(zhì)量、粉碎。稱取植物樣品于消煮管中，加入8 mL HNO3加蓋靜置12 h，放入消解爐（Di?giBlock ED54，中國）中消解，80 ℃消解1.5 h，120 ℃消解1.5 h，150 ℃消解3 h，去塞，180 ℃消解至管內(nèi)液體余1 mL后取出，加超純水定容至50 mL，加塞搖勻，Cu含量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，美國）進(jìn)行測定[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較分析（LSD 法）對不同處理間差異顯著性進(jìn)行比較（P＜0.05），數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同劑量Cu NPs對小油菜種子發(fā)芽的影響

本試驗(yàn)中，不同劑量Cu NPs 處理下的小油菜種子發(fā)芽率與對照（超純水）相比降低了0.7%～4.3%，各處理發(fā)芽率均無顯著差異（P＞0.05）（圖2），Cu NPs 對小油菜種子發(fā)芽率的抑制率方程為y=-2.3lnx+98.0（R2=0.923）。這與Stampoulis 等[12]、向壘等[8]研究結(jié)果一致。Stampoulis 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，1 000 mg·L-1Cu NPs處理不會對西葫蘆種子發(fā)芽造成影響。向壘等[8]研究表明0.2～8 mg·L-1納米氧化銅不會對白菜種子發(fā)芽率造成影響。這是由于種子發(fā)芽過程中主要由胚內(nèi)進(jìn)行養(yǎng)分供應(yīng)，所選用的小油菜種子有種皮，具有選擇透過性，其在保護(hù)胚胎免受有害外部因素的影響中起著非常重要的作用，可以降低外界污染對種子的毒害作用，只有受到極嚴(yán)重的污染時，種子發(fā)芽率才會受到明顯影響[13]。

圖2 Cu NPs對種子發(fā)芽的影響Figure 2 Effects of Cu NPs on seed germination

較低濃度的Cu NPs 會對小油菜的根伸長造成明顯影響（圖3A），當(dāng)Cu NPs 添加量為1 mg·L-1時，小油菜根伸長量與對照組相比增加了3.3%，不存在顯著性差異（P＞0.05）。Pradhan 等[14]研究表明，0.05～1 mg·L-1Cu NPs 會促進(jìn)綠豆根、莖伸長。陳曉華等[15]研究結(jié)果說明，Cu 屬于過渡金屬，是植物生長的必要微量營養(yǎng)元素，低濃度下可作為酶的輔助因子促進(jìn)藻類的光合作用，從而促進(jìn)其生長。當(dāng)Cu NPs 添加量為2、4、6、8、10 mg·L-1時，小油菜的根伸長量受到抑制，分別降低了10.7%、14.7%、49.5%、50.8%、59.9%，當(dāng)Cu NPs的添加量為6 mg·L-1時，抑制率達(dá)到50.0%（圖3B）。范功端等[3]指出0.3～1.3 mg·L-1Cu NPs 培養(yǎng)條件下斜生柵藻的生長被抑制，處理組細(xì)胞密度總體上顯著低于對照組（P＜0.05），2 mg·L-1Cu NPs 完全抑制斜生柵藻、四列藻和橢圓小球藻的生長。Kouhi 等[16]研究發(fā)現(xiàn)納米鋅會抑制6 種高等植物物種（蘿卜、甘藍(lán)型油菜、多花黑麥草、紫花苜蓿、玉米和黃瓜）的根系生長。Hussain 等[17]研究了30 mg·L-1Cu NPs 對苦艾蒿生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明在處理7 d 后苦艾蒿根長受到抑制。

Cu NPs 對小油菜莖伸長量的影響整體呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的趨勢（圖4A），Cu NPs 添加量為1 mg·L-1時，小油菜莖伸長量增加了2.2%，但與未添加Cu NPs處理組沒有顯著性差異（P＞0.05）；2 mg·L-1Cu NPs 對小油菜莖伸長有促進(jìn)作用，較對照顯著增加了9.1%；而當(dāng)Cu NPs 濃度≥4 mg·L-1時，會對小油菜莖伸長量造成顯著抑制作用（P＜0.05），與對照相比，小油菜莖伸長量降低4.8%～15.8%（圖4B）。Saharan 等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，添加0.08～0.12 mg·L-1Cu NPs 會促進(jìn)番茄莖伸長量增加，但是隨著添加量的增加促進(jìn)作用不斷降低。王磊等[19]研究了Cu 離子對萵苣柱高的影響，結(jié)果表明5 mg·L-1Cu 離子處理下萵苣株高產(chǎn)生抑制作用，但不顯著（P＞0.05）。

研究發(fā)現(xiàn)，小油菜根的伸長與Cu NPs 的暴露之間存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但是小油菜莖伸長沒有顯示出相同的結(jié)果，小油菜根部受到污染物的傷害比其他部位要明顯。這可能是由于小油菜種子發(fā)芽后，根是面對污染物的第一目標(biāo)組織，根系會直接與污染源進(jìn)行接觸且對Cu 的吸收能力較強(qiáng)，重金屬進(jìn)入到小油菜根部會抑制根尖細(xì)胞有絲分裂，抑制根系正常發(fā)育[20]。Cu 被小油菜根部吸收后存在滯留作用，阻礙了Cu 離子向莖、葉部位的運(yùn)輸，這也是植物抵御重金屬脅迫的方式之一，因此毒性癥狀會更多地出現(xiàn)在根中而不是枝條中[21]。納米顆粒的毒性可能歸因于兩種不同的作用，一是基于化學(xué)成分的化學(xué)毒性，也就是釋放的金屬離子；二是顆粒的表面、大小、形狀引起的應(yīng)力或刺激。雖然Rajak等[22]研究結(jié)果顯示Cu NPs 溶解釋放的Cu 離子含量較低，但正如Kouhi等[16]在評價納米氧化鋅對植物毒性效應(yīng)時所提到的，探究金屬納米顆粒對植物的毒性作用時，必須要考慮金屬離子的毒性。研究結(jié)果表明，Cu NPs 會比納米氧化鋅表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒性，推測Cu NPs 之所以會對小油菜根部造成更大程度的損傷，可能是由于選擇的Cu NPs 粒徑更小，更容易透過細(xì)胞壁達(dá)到質(zhì)膜，對小油菜根部的細(xì)胞組織造成破壞[13]。

圖3 Cu NPs處理對根伸長的影響Figure 3 Effects of Cu NPs on root elongation

圖4 Cu NPs對莖伸長的影響Figure 4 Effect of Cu NPs on shoot elongation

2.2 小油菜幼苗Cu含量和根細(xì)胞微觀特征的變化

不同濃度Cu NPs 處理下小油菜幼苗中Cu 含量見圖5。整體上小油菜幼苗Cu 含量隨Cu NPs 添加量增加而增加（y=1.8x3+8.7，R2=0.850）。與對照相比，當(dāng)Cu NPs 濃度≤2 mg·L-1時幼苗體內(nèi)Cu 含量增加不顯著（P＞0.05），而當(dāng)Cu NPs 濃度≥4 mg·L-1時小油菜幼苗體內(nèi)Cu 含量顯著增加（P＜0.05）。這是由于隨著Cu NPs 添加量的增加，其在水中的溶解量也會增加，導(dǎo)致更多的Cu離子進(jìn)入小油菜體內(nèi)[23]。

根據(jù)前文研究結(jié)果，選擇10 mg·L-1Cu NPs 處理下的小油菜根系部位進(jìn)行植株包埋超薄切片處理，觀察Cu NPs 對根系細(xì)胞的穿透效應(yīng)（圖6）。從圖中可以觀察到添加10 mg·L-1Cu NPs 使細(xì)胞出現(xiàn)比較普遍質(zhì)壁分離現(xiàn)象，這可能是由于Cu NPs 的添加對植物細(xì)胞造成損傷，ROS作為副產(chǎn)物攻擊蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激。秦世玉[24]的研究出現(xiàn)了類似結(jié)果，謝華[25]也在研究中發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫會使植物細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離趨向解體的現(xiàn)象。同時在小油菜根部細(xì)胞中，觀察到高電子密度的沉積物，與Cu NPs進(jìn)行形態(tài)對比，推測可能是Cu NPs 通過運(yùn)輸作用進(jìn)入到細(xì)胞中[26]。納米顆?？梢酝ㄟ^共質(zhì)體和質(zhì)外體兩條途徑進(jìn)入植物組織。與共質(zhì)體相比，質(zhì)外體的阻力較小，大多數(shù)在植物中的分布位點(diǎn)主要是細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙，說明質(zhì)外體途徑可能是主要運(yùn)輸方式[27]。對植物來說，細(xì)胞壁是納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞中的一大障礙。理論上納米材料的粒徑只有小于細(xì)胞壁孔徑才能進(jìn)入到細(xì)胞中。也有研究表明納米氧化銅及納米氧化鋅等會被細(xì)胞內(nèi)化，納米氧化鋅會誘導(dǎo)細(xì)胞壁產(chǎn)生較大的孔，然后通過這些孔進(jìn)入到植物組織中[28]。在玉米根細(xì)胞中觀察到含有納米氧化銅的包內(nèi)體，推測納米顆粒還可以通過胞吞作用進(jìn)行跨膜運(yùn)輸[29-30]。

圖5 不同Cu NPs處理下小油菜幼苗體內(nèi)Cu含量的變化Figure 5 Cu content in the seedling of Brassica chinensis L.under the treatments of Cu NPs

圖6 根部細(xì)胞的掃描電鏡圖Figure 6 Transmission electron microscope（TEM）of root cell

2.3 Cu NPs對小油菜幼苗酶活性的影響

植物體內(nèi)SOD、CAT、POD 等保護(hù)酶系統(tǒng)具有清除活性氧自由基的功能，以減輕活性氧對植物的傷害[24]。當(dāng)植物受到外界脅迫時，SOD 是植物防御機(jī)制的一道重要防線。如圖7A 所示，當(dāng)Cu NPs 添加量為1 mg·L-1時，SOD 活性達(dá)到最高，顯著高于對照和其他處理（P＜0.05）；當(dāng)Cu NPs 添加量為2～6 mg·L-1時，SOD 活性變化較對照相比變化不顯著（P＞0.05）；當(dāng)Cu NPs 添加量≥8 mg·L-1時，與對照相比SOD 活性被顯著抑制（P＜0.05），降低了50.6%～64.0%。Hussain等[17]研究表明Cu NPs 會使苦艾蒿SOD 活性下降。崔靜等[31]的研究也得到類似結(jié)果，證明金魚藻暴露于0～8 mg·L-1Cu NPs 后其SOD 活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。Nair等[32]研究發(fā)現(xiàn)，50 mg·L-1納米氧化銅會降低鷹嘴豆莖中Cu-Zn SOD的基因表達(dá)，而Antonio等[33]結(jié)果顯示Cu NPs 會增加番茄葉片SOD 活性。由于Cu是SOD合成的必要微量元素，低濃度（1 mg·L-1）Cu NPs處理促進(jìn)了SOD的表達(dá)，SOD活性增加。還可能是由于重金屬對植物的毒害作用增加了細(xì)胞中活性氧的含量，當(dāng)污染程度較低時植物體內(nèi)SOD會被激活，從而消除多余的活性氧來保持植物體內(nèi)平衡[32]。而隨Cu NPs濃度增加，SOD已經(jīng)不能消除其產(chǎn)生的毒害作用，或者是由于酶本身是一種蛋白質(zhì)，Cu NPs 會對蛋白質(zhì)造成損傷，使SOD受到抑制。

CAT 是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的抗氧化酶。植物中CAT 主要與抗逆性及氧化衰老等生理過程有關(guān)，植株中過氧化氫有雙重作用，一方面適量的過氧化氫可以作為誘導(dǎo)一系列防御機(jī)制的信號，另一方面過量過氧化氫會導(dǎo)致過氧化損傷，對植物組織造成損傷[34]。CAT 作為調(diào)節(jié)植物內(nèi)氧化還原動態(tài)平衡的重要酶，在植物抗毒害作用方面起著重要作用。本研究中，不同劑量Cu NPs 處理下小油菜幼苗CAT 活性變化不明顯（P＞0.05）（圖7B）。與對照相比，1～6 mg·L-1Cu NPs 處理下小油菜幼苗CAT 活性增加1.6%～8.8%，這可能是因?yàn)樵贑u NPs 污染下，CAT 有協(xié)助SOD 一起抵御自由基氧化的功能[35]。而當(dāng)Cu NPs 濃度≥8 mg·L-1時小油菜幼苗CAT 活性降低了4.7%～5.9%，這與Trujillo-Reyes 等[35]的結(jié)論類似。Nair 等[36]研究表明納米氧化銅沒有對綠豌豆莖中CAT 基因表達(dá)造成顯著影響（P＞0.05）。Hong 等[37]研究了Cu NPs對萵苣和苜蓿的毒性效應(yīng)，顯示CAT 活性總體上隨Cu NPs 濃度增加均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。這是由于外界毒性較低的情況下，CAT抵抗外界環(huán)境的脅迫作用導(dǎo)致活性增加，但是當(dāng)污染物添加濃度增加時，過量的Cu 可能通過Cu 離子代替鐵離子的活性中心而導(dǎo)致CAT 失活[32]。但Hernández-Hernández 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，10 mg Cu NPs 及殼聚糖共同作用下番茄CAT活性會提高111%，這可能是殼聚糖包封的Cu NPs顆粒毒性較高，而試驗(yàn)選用Cu NPs 粉末，可能由于選取濃度較小、毒性較低沒有顯著激活CAT 基因表達(dá)。在植物中，活性氧作為副產(chǎn)物，分布在不同細(xì)胞區(qū)室中的各種代謝途徑中，在生理穩(wěn)態(tài)條件下，這些分子通常被限于特定區(qū)室中的不同抗氧化防御成分清除。CAT 主要在光呼吸和脂肪酸的β-氧化過程中參與清除過氧化氫[15]。CAT 沒有表現(xiàn)出SOD 類似的變化趨勢，可能由于本試驗(yàn)采取室內(nèi)暗培養(yǎng)，小油菜幼苗沒有進(jìn)行光呼吸等過程。

圖7 不同Cu NPs處理下幼苗酶活性的變化Figure 7 The enzyme activity of seedlings under different Cu NPs treaments

POD 是在植物逆境條件下酶促防御反應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，它與SOD、CAT相互協(xié)調(diào)配合，使植物體內(nèi)保持正常的動態(tài)平衡[39]。Cu NPs 對小油菜幼苗POD 酶活性造成不同程度的抑制作用（圖7C）。與對照相比，小油菜幼苗POD 降低了4.4%～59.3%。當(dāng)Cu NPs 濃度≥2 mg·L-1時，小油菜幼苗POD 活性顯著受到抑制（P＜0.05），當(dāng)Cu NPs添加量為10 mg·L-1時，幼苗POD 活性最低。POD 是植物體內(nèi)普遍存在的一種酶，其對環(huán)境污染反應(yīng)十分靈敏。解凱琳等[40]的研究表明，重金屬脅迫會對植物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性，抑制植物的生理生化過程。POD 活性的顯著變化表明Cu NPs 引起的氧化脅迫超出了小油菜幼苗的抗氧化能力。植物體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生速率大于清除速率，活性氧無法及時被清除導(dǎo)致大量積累，對植物的細(xì)胞膜、細(xì)胞器造成傷害，進(jìn)而使保護(hù)酶活性不斷降低。小油菜體內(nèi)POD 活性未顯示出與CAT 活性相似的變化趨勢，這可能與過氧化氫直接轉(zhuǎn)化為過氧化物的量有限相關(guān)[12]。

3 結(jié)論

（1）Cu NPs 對小油菜種子發(fā)芽率影響不顯著（P＞0.05），但對根、莖伸長量造成抑制效應(yīng)。

（2）小油菜幼苗體內(nèi)Cu 含量隨Cu NPs 添加量增加而升高，10 mg·L-1Cu NPs 處理下小油菜根部細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，顯示對植物細(xì)胞造成一定的損傷。

（3）不同劑量Cu NPs 處理下，小油菜幼苗SOD 活性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，POD 活性顯著受到抑制，而CAT活性無顯著變化（P＞0.05）。