杜澍金，趙艷萌，周曉紅，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中醫(yī)藥防治心腦血管病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

腦血管疾病發(fā)病率高、致死/致殘率高，是我國居民致死的首位病因[1-2]，尤其是40歲以上人群每年新發(fā)腦卒中約300萬例，死亡110萬例，其中急性缺血性腦卒中約占80%，造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高達(dá)400億元/年[3]。缺血性腦卒中一般預(yù)后較差，治療的關(guān)鍵在于盡早恢復(fù)缺血區(qū)腦組織的血液再灌注，而恢復(fù)血液再灌注的過程有時(shí)反而引起更加嚴(yán)重的二次腦損傷，即腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。在CIRI的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥、氧自由基、鈣超載、毒性氨基酸、能量代謝等均可通過引起細(xì)胞凋亡、壞死導(dǎo)致腦組織病理損傷的發(fā)生，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損癥狀的出現(xiàn)。因此，防治細(xì)胞凋亡是抑制CIRI的重要環(huán)節(jié)。前期研究證實(shí)，臨床常用于中風(fēng)治療的中藥黃芪[4]的主要活性成分黃芪甲苷對CIRI有保護(hù)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)以PC12細(xì)胞為研究對象，通過建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型模擬CIRI對神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程，研究黃芪甲苷對腦缺血再灌注所致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

PC12細(xì)胞(經(jīng)NGF 誘導(dǎo)高分化)，由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室主任許順江教授惠贈。

1.2 主要試劑

黃芪甲苷(HY-N0099，MCE)；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM basic(1×)、胰蛋白酶、1×PBS緩沖液，均購于美國Gibco公司；Earle's平衡鹽溶液(1×EBSS，無鈣鎂糖)購自北京雷根生物科技有限公司；青鏈霉素混合液購自BIOND公司； Triton X-100、多聚賴氨酸均購自北京索萊寶科技有限公司；Bcl-2單克隆抗體、Caspase-3多克隆抗體購自Abcam公司；Bax多克隆抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、RIPA裂解液、PVDF膜、β-actin、蛋白maker、ECL發(fā)光液等購自塞維爾生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京中杉金橋科技有限公；MTS試劑盒，購自Promega公司。

1.3 主要儀器

3111型CO2培養(yǎng)箱，3131型三氣培養(yǎng)箱，Varioskan LUX型多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermo公司，超凈工作臺SW-CJ-ID型(蘇州凈化公司)，DMI3000B 型倒置顯微鏡，5417R型低溫離心機(jī)，酶聯(lián)免疫檢測儀，勻漿器，JA1203電子天平，Bio-rad電泳儀PowerPacTM HC及半干轉(zhuǎn)膜儀Trans- Blot SD Cell，UVP凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 PC12細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞于37 ℃水浴中迅速復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng) 1～2次傳代細(xì)胞處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好時(shí)，建立氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖模型。

1.5 氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖模型的建立及分組

對數(shù)期生長細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：Control組、Model組和AST-IV組。除Control組外，其他各組均氧糖剝奪2 h后復(fù)氧復(fù)糖24 h：棄去正常細(xì)胞培養(yǎng)液，用復(fù)溫的1×PBS緩沖液輕柔清洗細(xì)胞2遍后，更換為無糖的Earle's平衡鹽溶液以模擬細(xì)胞缺血狀態(tài)，然后將細(xì)胞置于94%N2+5%CO2+1%O2的37 ℃三氣培養(yǎng)箱中模擬缺氧狀態(tài)，培養(yǎng)(氧糖剝奪)2 h后，將Earle's平衡鹽溶液更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(復(fù)氧復(fù)糖)。同時(shí)，Control組細(xì)胞給予換液處理；AST-IV組于復(fù)氧復(fù)糖的同時(shí)給予含黃芪甲苷(終濃度為100 mmol/L)的培養(yǎng)液，Model組細(xì)胞給予正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)，并收集各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測。

1.6 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將PC12細(xì)胞傳代于6孔板中，正常培養(yǎng)24 h后，Control組繼續(xù)正常培養(yǎng)，Model組和AST-IV組先進(jìn)行氧糖剝奪2 h 處理。之后Control組細(xì)胞換液，Model組更換為正常培養(yǎng)液，AST-IV組更換為含黃芪甲苷(終濃度為100 mmol/L)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)(400×)，每組細(xì)胞取5個(gè)視野，拍照保存。

1.7 MTS法檢測細(xì)胞存活率

將對數(shù)生長期細(xì)胞傳代于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，按造模方法處理各組細(xì)胞后，于96孔板中每孔(100 mL)加入20 mL MTS溶液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，在多功能微孔板讀數(shù)儀中測定450 nm處OD值，檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)

造模結(jié)束后，用1×PBS緩沖液清洗細(xì)胞2遍；以一次性細(xì)胞刮刮取細(xì)胞于1.5 mL離心管中；4 ℃下，10 000 rpm離心5 min，棄去上清后再次離心2 min；再棄去上清，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞30 min；提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。調(diào)整上樣量后，按比例加入上樣緩沖液，混勻，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以5 %脫脂奶粉封閉2 h后，相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜液洗膜3次后，相應(yīng)HRP二抗室溫下孵育1 h。TBST洗滌后以ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。用UVP軟件采圖，分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞生長狀態(tài)

Control組細(xì)胞貼壁生長，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞折光性較強(qiáng)，呈多角形，突觸明顯，并交織成網(wǎng)。與Control組相比，Model組細(xì)胞貼壁較差，折光性減弱，細(xì)胞多呈圓形且聚集成團(tuán)，突觸減少甚至消失，部分細(xì)胞脫落、漂浮于培養(yǎng)液中。與Model組相比，AST-IV組細(xì)胞損傷減輕，折光性增強(qiáng)，突觸增多，趨向于正常生長。見圖1。

圖1 黃芪甲苷對氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.2 MTS法檢測PC12細(xì)胞存活率

與Control組相比，Model組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)；與Model組相比，AST-IV組細(xì)胞細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 黃芪甲苷對各組PC12細(xì)胞存活率的影響

2.3 黃芪甲苷對不同組別PC12 細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的Western blot檢測結(jié)果比較

與Control組相比，Model組PC12細(xì)胞Bax，Caspase-3的表達(dá)增多，Bcl-2表達(dá)減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Model組相比，AST-IV組PC12細(xì)胞Bax、Caspase-3的表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增多(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表2 黃芪甲苷對各組PC12細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase 3相對蛋白含量的影響

3 討論

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分化細(xì)胞株，經(jīng)誘導(dǎo)分化后具有交感神經(jīng)元特性，常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型是較理想的模擬腦缺血再灌注致神經(jīng)元損傷的細(xì)胞模型[6]。本實(shí)驗(yàn)以高分化PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖模型模擬臨床腦卒中患者經(jīng)溶栓或其他血管內(nèi)治療恢復(fù)血流灌注后的臨床病理過程中的神經(jīng)元損傷情況，即腦缺血再灌注所致的神經(jīng)元損傷，研究黃芪甲苷對CIRI的保護(hù)作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，再灌注的同時(shí)給予黃芪甲苷處理可以減輕氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖對PC12細(xì)胞的損傷，其保護(hù)作用體現(xiàn)在：改善細(xì)胞生長狀態(tài)和形態(tài)，提高損傷后細(xì)胞存活率，通過促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶Caspase-3蛋白表達(dá)，抑制PC12細(xì)胞凋亡。

Bcl-2具有抑制凋亡的作用，而Bax可促進(jìn)凋亡，兩者是在功能上相互對立的蛋白，其比值大小決定著損傷細(xì)胞是否趨于凋亡[7]。在生理狀態(tài)下，Bcl-2與Bax形成異源二聚體，穩(wěn)定線粒體膜的完整性，抑制Caspase-3的活化所介導(dǎo)的凋亡過程[8]；在病理狀態(tài)下，如細(xì)胞受到缺血、缺氧等有害刺激時(shí)Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增多，且向線粒體膜聚集，形成同源二聚體，導(dǎo)致線粒體通透性增高，致使線粒體內(nèi)凋亡因子如細(xì)胞色素C(Cyt C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)釋放入胞質(zhì)，進(jìn)而啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)及其他凋亡通路。因此Bax/Bcl-2增高，可促進(jìn)細(xì)胞趨于凋亡，反之則抑制細(xì)胞凋亡，且其促進(jìn)凋亡的機(jī)制與增大線粒體膜通透性，導(dǎo)致促凋亡物質(zhì)的釋放有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血引起的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡即是神經(jīng)元的凋亡，且神經(jīng)元的凋亡與缺血缺氧引起的起腦組織Bcl-2蛋白的一過性表達(dá)增加及Bax蛋白的持續(xù)表達(dá)增多有關(guān)[9]。而本研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖后PC12細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)的增多，導(dǎo)致Bax/Bcl-2減小，這可能是黃芪甲苷抑制CIRI所致神經(jīng)元凋亡的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖處理后，PC12細(xì)胞Bcl-2水平降低、Bax水平升高，表明細(xì)胞凋亡增多，而在復(fù)氧復(fù)糖的同時(shí)給予黃芪甲苷處理后，Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明黃芪甲苷增強(qiáng)了細(xì)胞對抗凋亡的能力。

Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中起著不可替代的作用，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。有研究證實(shí)黃芪甲苷與三七有效成分配伍可降低Caspase-3 蛋白的表達(dá)量，抑制CIRI小鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)黃芪甲苷可降低氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖所致PC12細(xì)胞Caspase-3 蛋白的表達(dá)增多，從而抑制細(xì)胞凋亡，提升細(xì)胞存活率。

腦缺血再灌注損傷繼發(fā)于腦卒中恢復(fù)血液灌注之后，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，病理過程涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，包括能量代謝障礙、興奮性氨基酸釋放、胞內(nèi)鈣超載、氧自由基增多、炎性因子釋放等，這些因素相互作用、互為因果，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死，進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀及不良預(yù)后[11]。目前，對于CIRI的治療包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載及中醫(yī)藥類神經(jīng)保護(hù)措施。近年來中醫(yī)藥治療以其多靶點(diǎn)、多功效性，在CIRI中的研究逐漸增多。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣虛、血瘀為腦中風(fēng)發(fā)作的病因病機(jī)，治療上宜采用益氣活血、祛瘀通絡(luò)類方藥，其中補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)用于治療缺血性腦卒中的經(jīng)典方劑，其使用歷史悠久，已逾數(shù)千年。黃芪甲苷作為補(bǔ)陽還五湯君藥黃芪的主要活性成分之一[12]，具有清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等生物活性[13-15]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃芪甲苷對CIRI具有保護(hù)作用[5,16]：黃芪甲苷可以改善實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注動物模型的神經(jīng)功能學(xué)評分、縮小其腦梗死體積；同時(shí)，在模擬腦缺血再灌注損傷的體外模型中發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以提升氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖導(dǎo)致的PC12和HT22細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞凋亡率，改善細(xì)胞生長狀態(tài)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)黃芪甲苷可通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮對氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，機(jī)制與促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax和細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶Caspase-3表達(dá)有關(guān)。本課題將在動物水平和細(xì)胞水平進(jìn)一步探究黃芪甲苷對CIRI的保護(hù)作用及機(jī)制。