張妍妍，邢希旺，敖鵬，劉玉婕，肖洪彬*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天津科倫藥物研究有限公司，天津 300457)

流行病學(xué)研究表明，全球類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的平均發(fā)病率在0.5%～1%之間，而我國大陸地區(qū)類RA的發(fā)病率為0.42%[1]。盡管從發(fā)病率來看，我國屬于RA低發(fā)病率國家，但是由于我國龐大的人口基數(shù)和人口結(jié)構(gòu)的老齡化，近年來我國RA患者逐年增加。RA是一種慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)炎性病變?yōu)橹鳎绮患右钥刂茣?dǎo)致關(guān)節(jié)骨組織的損傷、畸形甚至喪失功能[2]。RA的高致殘率不僅影響患者本身的生活質(zhì)量，而且為家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

由于病因尚未完全清晰，因此目前西醫(yī)無法根治RA，主要以免疫抑制劑和非甾體抗炎藥控制癥狀。中醫(yī)學(xué)在這方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，研究表明多種天然藥物中的活性成分，不僅可以有效緩解RA的癥狀，而且能夠從一定程度上延緩疾病的進(jìn)展[3-5]。中藥伸筋草(Lycopodium Clavatum)為石松科植物，《本草拾遺》中記載：味苦辛，溫，無毒。伸筋草歸肝、脾、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)的功效，中醫(yī)臨床常用于治療關(guān)節(jié)酸痛、屈伸不利?，F(xiàn)代研究表明，伸筋草具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[6]。

本研究采用注射弗氏完全佐劑的方法復(fù)制大鼠RA模型，通過大鼠滑膜組織HE染色病理變化、細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase，MMP-3)的表達(dá)以及OPG/RANKL/RANK信號通路來探討伸筋草治療RA的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級，健康SD大鼠66只(多備10%的實(shí)驗(yàn)動物備用)，5～6月齡，體質(zhì)量(200±20)g，雄性，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h-12 h明暗自動切換(7:00—19:00)；溫度控制：(25±2)℃；相對濕度控制：45%～75%。所有實(shí)驗(yàn)動物均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(吉)-2018-0007。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

弗氏完全佐劑(批號：1002036152，西格瑪公司)，II型膠原(牛，凍干粉，Chondrex，批號：150342)，兔抗大鼠CD4單抗(廣州健侖生物科技有限公司，批號：20170315)，大鼠ICAM-1、MMP-3單抗(碧云天生物，批號：AF2443、AF1618)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

伸筋草總生物堿提取物：實(shí)驗(yàn)室自制，取適量加蒸餾水溶解，制得每mL含伸筋草生藥量0.054 g的伸筋草提取物濃縮液。

雷公藤多苷片：遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號：20170301。用羧甲基纖維素鈉配制成雷公藤多苷-CMC混懸液2.5 mg/mL。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器

透射電鏡(荷蘭ASI，型號：Chee-tah120 Timepix)，恒溫箱(東莞市愛佩試驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：AP-HX)，全自動免疫組化染色機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司，型號：MY-2300)，電泳儀(美國Bio-rad，型號：1658033)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型復(fù)制

將II型膠原(牛)凍干粉溶解于0.1 mol/L的醋酸中，制成2 mg/mL的II型膠原(牛)醋酸溶液，備用。將大鼠腹腔注射劑量為40 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后仰位固定于手術(shù)臺。對大鼠進(jìn)行右后足趾、尾根、背部3個(gè)部位皮下注射配置好的II型膠原(牛)醋酸溶液。每只大鼠3個(gè)位點(diǎn)共注射0.15 mL，注射10 d后，每只大鼠相同部位重復(fù)注射1次，以激發(fā)免疫反應(yīng)[7]。另取10只正常對照組大鼠每次注射相同體積的生理鹽水。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

按照2.1項(xiàng)下的方法，第二次皮下注射后第3天觀察大鼠后趾、尾部、耳部腫脹情況，以尾部、耳部和后趾出現(xiàn)炎性紅腫或者結(jié)節(jié)為成功復(fù)制RA模型的標(biāo)志。將RA模型復(fù)制成功的50只Wistar雄性大鼠，按照體質(zhì)量區(qū)組化隨機(jī)分為5組，即模型組、伸筋草高、中、低3個(gè)劑量組和陽性對照組，每組10只。

2.3 HE染色大鼠滑膜組織

在第二次皮下注射第4日起，各組大鼠開始灌胃給藥。伸筋草高、中、低劑量組每日分別給藥1.6 g/kg、0.8 g/kg、0.4 g/kg伸筋草提取物濃縮液(以伸筋草生藥量計(jì))；正常對照組和模型組大鼠每日分別灌胃給予等體積的生理鹽水；陽性對照組每日灌胃5.4 mg/kg雷公藤多苷混懸液(以雷公藤多苷計(jì))，連續(xù)21 d。于末次給藥后次日將大鼠麻醉后，脫頸處死，取右后踝關(guān)節(jié)，鈍性剝離關(guān)節(jié)滑膜組織置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。用4%的多聚甲醛固定，10%濃度的EDTA溶液進(jìn)行脫鈣，梯度濃度乙醇脫水后[8]，用石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠滑膜組織病理變化。

2.4 免疫組化方法測定滑膜組織ICAM-1、MMP-3

將大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織切片后置于60 ℃的環(huán)境下1 h后，脫蠟復(fù)水。將切片用雙氧水和PBS反復(fù)洗滌各3次，添加一抗37 ℃恒溫1 h后，PBS反復(fù)沖洗3次，添加二抗，37 ℃溫育20 min后，加入SABC，37 ℃溫育30 min。漂洗后加入顯色劑。蒸餾水沖洗后，光鏡下觀察染色結(jié)果。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，用Image Pro Plus系統(tǒng)自動定量分析陽性區(qū)域光密度值。

2.5 Western Blot方法測定滑膜組織OPG、RANKL蛋白的表達(dá)

將低溫冷凍保存的各組大鼠滑膜組織粉碎后，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(蛋白上樣量為50 μg)，恒流電轉(zhuǎn)到PVDF膜后TBST漂洗，加入5%脫脂奶粉避光封閉2 h后漂洗3次，加入一抗(RANKL、OPG的1/1 000稀釋液)4 ℃恒溫過夜。漂洗3次后添加二抗(RANKL、OPG的1/5 000稀釋液)，TBST漂洗3次后加入ECL，曝光后分析條帶分子量及灰度值(選擇GAPDH為內(nèi)參蛋白)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 伸筋草對RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理的影響

HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。正常對照組大鼠滑膜組織細(xì)胞排列整齊規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，膜表面光滑未見增生，無炎性細(xì)胞浸潤和血管充血；模型組有明顯的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎性浸潤，滑膜組織細(xì)胞排列不規(guī)則，增生腫脹明顯。與模型組相比，陽性對照組和伸筋草高劑量組大鼠滑膜組織增生和炎性細(xì)胞浸潤顯著改善；伸筋草中、低劑量組有一定的緩解但不明顯。

圖1 RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色(×400)

3.2 伸筋草對RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織ICAM-1、MMP-3表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。與正常對照組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織ICAM-1、MMP-3的表達(dá)均顯著升高，伸筋草高、中、低劑量組均可以降低滑膜組織ICAM-1、MMP-3的水平，且呈劑量依賴性，其中高劑量伸筋草降低ICAM-1效果顯著(P<0.05)，高中劑量組降低MMP-3作用明顯(P<0.05)。

表1 伸筋草對RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織ICAM-1、MMP-3表達(dá)的影響

3.3 伸筋草對RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)及RANKL/OPG比值的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、表2。

表2 伸筋草對RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)及RANKL/OPG比值的影響

注：1.正常對照組；2.模型組；3.伸筋草高劑量組；4.伸筋草中劑量組；5.伸筋草低劑量組；6.陽性對照組。圖2 伸筋草對OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響Western Blot電泳圖

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與空白對照組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中OPG、RANKL蛋白表達(dá)及RANKL/OPG的比值均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，伸筋草各劑量組均可以降低OPG、RANKL表達(dá)和RANKL/OPG比值的趨勢，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。高劑量組作用效果最佳，中劑量組次之，低劑量組雖有降低的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

RA是一種自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)骨損傷和慢性炎癥為主要特征。主要病理改變包括滑膜組織炎性細(xì)胞的浸潤、滑膜組織細(xì)胞的腫脹、充血、增生以及成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞代謝的改變[9]。我國目前的RA患者超過500萬，RA嚴(yán)重危害我國老年人群的健康，臨床急需療效確切且安全性高的藥物。

伸筋草又名舒筋草，中醫(yī)用于治療關(guān)節(jié)腫痛、風(fēng)寒濕痹、筋脈拘急。多個(gè)基礎(chǔ)研究表明伸筋草具有降低RA大鼠血清中炎性因子和鎮(zhèn)痛的作用[8]。本研究通過對大鼠滑膜組織的病理分析可知，伸筋草具有明顯的對抗RA大鼠滑膜組織增生和炎性浸潤的作用。這部分研究為后續(xù)探討伸筋草治療RA的作用機(jī)制奠定了藥效基礎(chǔ)。

ICAM-1是黏附分子中免疫球蛋白超家族的一員，是一種含有505個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，廣泛存在于多種細(xì)胞表面。細(xì)胞膜上的ICAM-1主要與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LAF-1)相結(jié)合[10]，進(jìn)而趨化血管中的白細(xì)胞向炎癥發(fā)生的組織聚集，并促進(jìn)多種炎性細(xì)胞的黏附，如單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等[11]。MMP-3是研究較多的一類基質(zhì)金屬蛋白酶，參與了滑膜組織成纖維細(xì)胞的侵襲和致病過程。臨床研究表明，MMP-3在RA患者關(guān)節(jié)組織的表達(dá)是正?；颊叩?倍以上[12]，因此臨床上常將患者關(guān)節(jié)液中MMP-3的水平作為早期鑒別診斷RA的重要生化指標(biāo)和治療的主要療效指標(biāo)[13-14]。本研究免疫組化的結(jié)果顯示伸筋草可以通過降低RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織炎性因子的趨化、聚集、黏附來發(fā)揮治療作用。

細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of the nuclear factor kappa B ligand, RANKL)，主要由成骨細(xì)胞表達(dá)，而RANK(Receptor activator of the nuclear factor kappa B)主要存在于破骨細(xì)胞的表面。RANKL與RANK結(jié)合后，會激活下游信號通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟和分化，這就使成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間的平衡被打破，造成骨形成受損、骨吸收增加，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍骨量減少、骨侵蝕和骨損傷[15]。OPG(Osteoprotegerin)俗稱骨保護(hù)素是一種分泌型糖蛋白，屬于TNF受體家族成員，最早是在1997年被發(fā)現(xiàn)，OPG可以抑制破骨細(xì)胞的形成。OPG能夠與RANKL競爭性結(jié)合，從而抑制RANKL與RANK的結(jié)合，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的過度分化、生成[16]。由此可以看出OPG/RANKL/RANK信號通路對成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞動態(tài)平衡的調(diào)控起著十分重要的作用。而RANKL/OPG的相對比值對于這個(gè)動態(tài)平衡的保持起到了關(guān)鍵作用[17]，這個(gè)比值能間接反映OPG/RANKL/RANK信號通路的激活程度。本研究Western Blot的結(jié)果表明伸筋草不僅可以降低滑膜組織OPG、RANKL蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可以降低RANKL/OPG的比值，證明伸筋草可以通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK信號通路在一定程度上恢復(fù)成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡，減少RA大鼠踝關(guān)節(jié)的損傷。

綜上所述，伸筋草治療弗氏佐劑所致大鼠RA的療效確切，其可以降低大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織炎性因子的水平，并通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK信號通路來發(fā)揮治療RA的作用。