胡嘯明,黃仁燕,韓強(qiáng),嚴(yán)仕夢,柳國斌*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中醫(yī)血管外科，上海 201203;2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240)

創(chuàng)面修復(fù)是臨床上外科醫(yī)生經(jīng)常面對的難題之一，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，急性創(chuàng)面一般預(yù)后較好，但常因治療不當(dāng)或患者基礎(chǔ)疾病的原因，易遷延形成慢性難愈性創(chuàng)面，少數(shù)有癌變可能。因此，早期急性創(chuàng)面的處理至關(guān)重要。

已有研究提示在創(chuàng)面愈合過程中，細(xì)胞的自噬水平呈動態(tài)變化，決定創(chuàng)面最終的轉(zhuǎn)歸。現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，使我們對外科創(chuàng)面愈合機(jī)制的認(rèn)識深入到了細(xì)胞與分子水平，從而為指導(dǎo)臨床治療提供了有力的支撐。前期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，中藥外用制劑的有效應(yīng)用，能促進(jìn)創(chuàng)面快速愈合，尤其在慢性難愈性創(chuàng)面中優(yōu)勢明顯。因此，本研究觀察以“清熱祛腐生肌法”組方的中藥紫朱軟膏對急性創(chuàng)面愈合的療效、作用機(jī)制以及自噬和創(chuàng)面愈合的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取雄性SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量(250±20)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0002，飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，常規(guī)飲食進(jìn)水，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度: 20～25℃，相對濕度40%～50%，光照周期12 h/日。

1.1.2 藥物與試劑

紫朱軟膏(100 kg生產(chǎn)處方量包括生藥朱砂3.5 kg，紫草1.5 kg，龍血竭3 kg，黃芪1.5 kg，阿膠2.5 kg，冰片0.5 kg,輔料白凡士林、羊毛脂、泊洛沙姆等共87.5 kg)為院內(nèi)經(jīng)驗(yàn)方，委托馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司按照制作工藝和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)。生理鹽水，四川科技藥業(yè)股份有限公司。4%多聚甲醛、蘇木精染液、1%伊紅酒精溶液，國藥集團(tuán)(滬試)，2.5%戊二醛、丙酮、3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛，上海生工生物工程技術(shù)有限公司。PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，碧云天生物工程有限公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit(for real time)、SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus)，日本TAKARA公司，Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9、TGF-β一抗和GAPDH，美國Sigma公司。

1.1.3 儀器

EG1160包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、HI1120水平式烘干儀(型號：德國Leica)，正置顯微鏡(型號：日本Olympus)，透射電子顯微鏡(型號:荷蘭FEI Tecnai G2 Spirit TEM)，電泳儀(型號：EPS 300，上海)，微型垂直電泳槽(型號：VE 180，上海)，熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：ChemiQ4600，上海)，熒光定量PCR儀(型號：瑞士羅氏LightCycler?96)。

1.2 造模與分組

實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，第4天進(jìn)行造模。①麻醉：10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射，每只劑量標(biāo)準(zhǔn)3 mL/kg；②脫毛：后背部6×4 cm2范圍(后脊正中線兩側(cè)各延伸3 cm；③制作皮膚創(chuàng)面：以后脊正中線旁開2 cm，用皮膚打孔器(規(guī)格內(nèi)徑12 mm)于脫毛區(qū)域鉆孔，順鐘向旋轉(zhuǎn)，待皮膚分離，用眼科剪配合連帶皮下筋膜一并剪去，止血。造模成功后，大鼠按體質(zhì)量編號，生成隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)分為對照組和治療組，每組 15只。

1.3 干預(yù)

治療組給予紫朱軟膏按0.032 g/cm2比例外用換藥，1次/d；對照組給予生理鹽水外用換藥，1次/d；觀察周期21 d。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

在創(chuàng)面形成后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d共5個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)每組各取3只大鼠，分別進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.4.1 創(chuàng)面愈合率

將數(shù)碼相機(jī)(5D Mark III，Canon公司，日本)采集的圖片導(dǎo)入計算機(jī)，選出最清晰圖片，用Image-Pro Plus Version 6.0軟件計算4、7、14、21 d創(chuàng)面面積，再計算創(chuàng)面愈合率[1],創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.4.2 組織學(xué)觀察

剪取創(chuàng)面組織標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察創(chuàng)面組織形態(tài)[2]。

1.4.3 自噬體觀察

2.5%戊二醛固定，丙酮脫水、包埋、固化、超薄切片機(jī)切成50～60 nm切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察兩組大鼠在各時相點(diǎn)的創(chuàng)面組織細(xì)胞的自噬體形態(tài)、結(jié)構(gòu)[3]。

1.4.4 Western Blot法檢測目的蛋白

取大鼠皮膚創(chuàng)面組織50 mg，加入適當(dāng)量的裂解液，比例為1∶100，充分裂解后，11 000 r/min的4 ℃離心機(jī)離心10 min，取上清。按照BCA定量法計算出蛋白濃度，補(bǔ)充適量RIPA液，加入 loading buffer，使各個樣本等體積等量上樣，煮沸5 min使蛋白變性。50 μg上樣量，用15%分離膠使蛋白分離，半干轉(zhuǎn)膜200 mA，1 h使蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜( 一抗稀釋比例1∶1 000，β-actin作為內(nèi)參) ，二抗(稀釋比例1∶1 000)常溫孵育30 min，暗室發(fā)光，顯影，洗片。拍照，用Image J軟件計算灰度值并進(jìn)行分析。

1.4.5 RT-PCR法檢測目的基因

取大鼠皮膚創(chuàng)面組織100 mg置于研缽中，加入500 μL TRIzol試劑及100 μL氯仿提取總RNA，應(yīng)用Prime ScriptTM RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增以檢測各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β mRNA的表達(dá)水平。擴(kuò)增引物由美國Thermo Fisher Scientific公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)處理2 min，循環(huán)1次；95 ℃預(yù)變性30s，循環(huán)1次；95 ℃變性5 s，循環(huán)40次；60 ℃退火34 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。各組均設(shè)3個復(fù)孔。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物信息

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合率

4 d，兩組組創(chuàng)面逐漸縮小，無明顯液性滲出。7 d時，兩組創(chuàng)面邊緣區(qū)域部分已結(jié)痂，逐漸向中心靠攏，紫朱軟膏組創(chuàng)面愈合率達(dá)到45%，兩組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。14 d時，兩組創(chuàng)面面積縮小明顯，愈合面積過半，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。21 d時，紫朱軟膏組已基本愈合，愈合率達(dá)到 98%，高于對照組，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。見表2、圖1和圖2。

表2 兩組創(chuàng)面愈合率的比較

圖1 兩組創(chuàng)面愈合情況

圖2 兩組創(chuàng)面愈合率比較

2.2 組織學(xué)觀察

7 d時，與對照組相比，紫朱軟膏組有較多成熟肉芽組織和新生毛細(xì)血管；14 d時，紫朱軟膏組初步形成毛細(xì)血管網(wǎng)，上皮組織可見排列較整齊的膠原纖維組織，而對照組上皮組織間隙較多，未見成熟的膠原纖維；21 d時，紫朱軟膏組形成規(guī)則的毛細(xì)血管網(wǎng)，一定數(shù)量的腺體結(jié)構(gòu)，而對照組相對較少(見圖3)。

圖3創(chuàng)面組織HE染色(×100)

2.3 自噬體觀察

透射電鏡拍照結(jié)果如下圖所示，7 d時，可以看出NS組出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，細(xì)胞核染色質(zhì)開始凝集，核膜有凹陷，胞漿中出現(xiàn)有多層膜或雙層膜包繞的泡狀結(jié)構(gòu)即自噬泡；14 d時,NS組自噬現(xiàn)象明顯比7 d時有所增加。相同時相點(diǎn)，紫朱軟膏組細(xì)胞核染色質(zhì)凝集現(xiàn)象明顯，核染色質(zhì)在核質(zhì)中呈塊狀凝集，大小不等地分散于核質(zhì)內(nèi)，但自噬泡均較對照組明顯減少(見圖4)。

圖4 創(chuàng)面組織內(nèi)自噬體的電鏡觀察(Bar=2 μm),紅色箭頭所示為自噬體

2.4 Beclin-1 、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β蛋白的檢測

對照組14 d時Beclin-1 、LC3蛋白的表達(dá)要高于前一時間點(diǎn)7 d，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；MMP-9蛋白的表達(dá)在不同時間點(diǎn)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，7 d<14 d<21 d；各時相點(diǎn)IL-1β蛋白的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，7 d>14 d>21 d。相同時間點(diǎn)，紫朱軟膏組Beclin-1 、LC3、IL-1β蛋白的表達(dá)要弱于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，MMP-9和TGF-β的表達(dá)要強(qiáng)于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(見表3、圖5)。

表3 兩組創(chuàng)面目的蛋白的表達(dá)比較

注:Z指紫朱軟膏，N指生理鹽水。圖5 兩組創(chuàng)面LC3、Beclin-1、IL-1β、MMP-9和TGF-β蛋白的表達(dá)

2.5 Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β基因的檢測

2.5.1 各時相點(diǎn)Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β mRNA的表達(dá)變化

對照組各時相點(diǎn)Beclin-1、LC3、MMP-9和TGF-β mRNA的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，7 d<14 d<21 d；IL-1β mRNA的表達(dá)在不同時相點(diǎn)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，7 d>14 d>21 d。4 d時，紫朱軟膏組LC3 、TGF-β mRNA的表達(dá)要弱于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，MMP-9 mRNA的表達(dá)要高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；7 d時，紫朱軟膏組IL-1β、TGF-β mRNA的表達(dá)要弱于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，紫朱軟膏組MMP-9 mRNA的表達(dá)要高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；14 d時，紫朱軟膏組Beclin-1、TGF-β mRNA的表達(dá)要弱于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，紫朱軟膏組MMP-9 mRNA的表達(dá)要高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；21 d時，紫朱軟膏組IL-1β mRNA的表達(dá)要弱于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，紫朱軟膏組MMP-9、TGF-β mRNA的表達(dá)要高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(見表4)。

表4 兩組創(chuàng)面目的基因的表達(dá)比較

2.5.2 各時相點(diǎn)IL-1β、MMP-9和TGF-β和自噬基因LC3 mRNA表達(dá)變化的相關(guān)性

創(chuàng)傷14 d時，IL-1β表達(dá)量與LC3顯著正相關(guān)(r=0.953，P<0.01)；創(chuàng)傷4 d和14 d時，MMP-9表達(dá)量與LC3顯著負(fù)相關(guān)(4 d：r-0.916，P=0.01；14 d：r=-0.756，P=0.019)。創(chuàng)傷4 d、7 d和21 d時，TGF-β表達(dá)量與LC3顯著負(fù)相關(guān)(4 d：r=-0.911，P=0.001；7 d：r=-0.862，P<0.03；21 d：r=-0.860，P=0.03)(見圖6～8)。

圖6 各時相點(diǎn)LC3與IL-1β的相關(guān)性分析

圖7 各時相點(diǎn)LC3與MMP-9的相關(guān)性分析

圖8 各時相點(diǎn)LC3與TGF-β的相關(guān)性分析

3 討論

在自噬和創(chuàng)面愈合關(guān)系的各種研究中結(jié)果顯示其具有一定的關(guān)聯(lián)性，在燒傷創(chuàng)面中，Beclin-1自噬相關(guān)基因高表達(dá)，增加自噬活性有利于創(chuàng)面愈合[4]。然而，同時也存在過度的自噬活性表達(dá)導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲的情況。在多項(xiàng)涉及患者或大鼠模型實(shí)驗(yàn)的研究中[5-7]，應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素，機(jī)體最終出現(xiàn)創(chuàng)面延遲愈合。目前，幾種小分子調(diào)節(jié)劑如雷帕霉素、海藻糖、鋰和利美尼定參與了自噬途徑，已經(jīng)確定能夠調(diào)節(jié)自噬活性。然而，這些調(diào)節(jié)劑在臨床上的應(yīng)用仍然有限。常見的雷帕霉素的自噬誘導(dǎo)過程相對緩慢，具有較長的間接作用時間，而且其作用始終是暫時的[8]。因此，尋找新的理想自噬調(diào)節(jié)劑在臨床上具有重要的應(yīng)用價值。

中醫(yī)藥在治療創(chuàng)面愈合方面具有顯著優(yōu)勢，且多項(xiàng)研究顯示中醫(yī)藥對自噬具有調(diào)節(jié)作用[9-12]。中醫(yī)認(rèn)為創(chuàng)面的主要病理因素責(zé)之于“熱”“瘀”“虛”，病機(jī)為“因虛致瘀、瘀久化熱、熱盛肉腐”，因此以“補(bǔ)氣化瘀、清熱解毒、化腐生肌”理論來指導(dǎo)創(chuàng)面的治療[13]。創(chuàng)面愈合不良的因素往往是炎癥反應(yīng)過激及相關(guān)生長因子分泌不足，而清熱祛瘀生肌中藥具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)生長因子生成的作用[14-16]。紫朱軟膏是以“清熱祛腐生肌法”組方，借鑒我國著名中醫(yī)外科大家奚九一教授的經(jīng)驗(yàn)方“撈底膏”，在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化形成的經(jīng)驗(yàn)方，全方以朱砂、紫草為君，其中朱砂具解毒祛腐之功；紫草有涼血活血之效，兩君相得益彰，共湊清“熱”解毒、祛腐化“瘀”之效；黃芪味甘性微溫，為補(bǔ)氣生肌之要藥，托毒退腫之上品，阿膠、血竭同為甘平之品，均有補(bǔ)血生肌之功，其中阿膠補(bǔ)血滋陰俱佳，血竭為治療潰瘍不斂之要藥，三者共為臣藥，補(bǔ)氣血之“虛”；佐以冰片，味辛，通透肌腠以助藥效，有效的針對了“熱”“瘀”“虛”病理因素。在本研究中，與對照組比較，紫朱軟膏組愈合率高，愈合時間短，創(chuàng)面血管新生、再上皮化速度快，體現(xiàn)出了較好的療效。

創(chuàng)面修復(fù)是一個連續(xù)復(fù)雜的過程，主要包括炎癥階段、增殖階段、組織重塑階段3個密切聯(lián)系、交互重疊的階段。在此過程中，細(xì)胞的自噬水平呈動態(tài)變化。在本研究中，14 d時電鏡觀察創(chuàng)面自噬現(xiàn)象明顯比7 d時有所增加，相同時相點(diǎn)，紫朱軟膏組自噬泡均較對照組明顯減少；各時相點(diǎn)自噬基因Beclin-1和LC3的表達(dá)隨時間逐漸升高，相同時相點(diǎn)，紫朱軟膏組Beclin-1和LC3的表達(dá)要弱于對照組，說明紫朱軟膏組可能通過抑制細(xì)胞的自噬活性從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

而在創(chuàng)面愈合的各個階段，自噬發(fā)揮的作用有所不同：①炎癥階段，自噬具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用，適度的炎癥反應(yīng)有利于去除異物、細(xì)菌和受損組織以防止加重感染，過度持續(xù)性、慢性炎癥反應(yīng)會造成創(chuàng)面愈合障礙。自噬可通過調(diào)節(jié)促炎與抑炎因子的表達(dá)，使創(chuàng)面炎癥反應(yīng)趨于平衡，有利于創(chuàng)面修復(fù)。自噬體將細(xì)胞質(zhì)成分傳遞給溶酶體進(jìn)行降解，而炎癥小體是受感染或應(yīng)激激活的分子平臺，這些分子平臺調(diào)節(jié)白介素1β(IL-1β)和IL-18等的成熟。SHI等[17]數(shù)據(jù)表明自噬伴隨著炎癥小體活化，活性炎癥小體消除可緩解炎癥。本研究中，IL-1β 表達(dá)量與LC3顯著正相關(guān)，說明自噬活性增強(qiáng)會加重炎癥反應(yīng)。同一組別IL-1β的表達(dá)隨著時間變化逐漸下降，而兩組同一時相點(diǎn)，紫朱軟膏組IL-1β的表達(dá)要弱于對照組，表明紫朱軟膏組可以抑制過度的炎癥反應(yīng)。②增殖(血管新生和上皮化)階段，氧化應(yīng)激會引起局部代謝產(chǎn)物堆積和營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)一步損傷，自噬在增殖階段發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，通過控制對氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)來減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和分化。LONG等[18]人的研究表明，誘導(dǎo)降低氧化應(yīng)激水平，可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的遷移和增殖相關(guān)基因的表達(dá)。巨噬細(xì)胞對于創(chuàng)面修復(fù)至關(guān)重要，LIAO等[19]研究顯示上調(diào)自噬水平，通過MAPK1/3磷酸化途徑增加MMP9的活性可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移。本研究中， MMP-9 表達(dá)量與LC3顯著負(fù)相關(guān)，細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)減少了MMP-9的表達(dá)，與既往研究不盡相同。同一組別MMP-9的表達(dá)隨時間逐漸升高，而兩組同一時相點(diǎn)，紫朱軟膏組MMP-9的表達(dá)要強(qiáng)于對照組，表明紫朱軟膏組表現(xiàn)出更好的血管新生、上皮化能力。③組織重塑階段，主要涉及成纖維細(xì)胞(FB)的過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積，自噬可通過調(diào)控FB的凋亡和ECM的合成與降解來促進(jìn)組織瘢痕的重建。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是創(chuàng)面修復(fù)中的重要信號分子，可調(diào)節(jié)各種類型細(xì)胞的增殖、分化和死亡，其參與膠原及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，TGF-β與瘢痕愈合有關(guān)，可誘導(dǎo)體內(nèi)各種組織纖維化反應(yīng)等[20]。DING等[21]研究表明，LC3缺乏誘導(dǎo)自噬水平降低可引起促纖維化因子TGF-β的升高，從而導(dǎo)致膠原沉積的增加和成熟，加速纖維化進(jìn)程。本研究中，TGF-β表達(dá)量與LC3顯著負(fù)相關(guān)，細(xì)胞自噬活性減弱有利于TGF-β的產(chǎn)生；而同一組別TGF-β的表達(dá)隨時間逐漸升高，兩組同一時相點(diǎn)，紫朱軟膏組TGF-β的表達(dá)要強(qiáng)于對照組，表明紫朱軟膏組更易誘導(dǎo)組織纖維化形成瘢痕。

本研究結(jié)果表明，紫朱軟膏的作用機(jī)制可能是在創(chuàng)傷修復(fù)過程中抑制細(xì)胞的自噬活性，通過下調(diào)IL-1β的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，上調(diào)MMP-9和TGF-β的表達(dá)促進(jìn)血管新生、組織纖維化，從而達(dá)到創(chuàng)面愈合的目的。相關(guān)研究結(jié)果顯示，IL-1β能通過增強(qiáng)MMP-9 mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而介導(dǎo)MMP-9的高表達(dá)[6]。也有研究表明，MMP-9可通過其水解作用使TGF-β轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)[22]。MMP-9可能在創(chuàng)面修復(fù)自噬機(jī)制中承擔(dān)著關(guān)鍵角色，有可能成為潛在的治療靶點(diǎn)，但有待進(jìn)一步深入研究證實(shí)。