吳遵秋， 孔祥耀， 黎小梅， 于世博， 唐毅， 陳明翠， 倪穩(wěn)， 陳良繼， 孫見飛

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 化學(xué)與生物化學(xué)實驗室， 貴州 貴陽 550025)

有柄石韋[Pyrrosiapetiolosa(Christ)Ching，P.petiolosa]在我國分布十分廣泛，是一種水龍骨科石韋屬下的藥用蕨類植物。在傳統(tǒng)的中醫(yī)藥學(xué)體系中，P.petiolosa具有非常重要的藥用價值，其多個部位已經(jīng)被研究證實并用于治療如皮膚局部炎癥、腎盂腎炎、慢性支氣管炎及泌尿系統(tǒng)感染等疾病[1]。皮膚傷口愈合初期的局部炎癥反應(yīng)是傷口愈合的基礎(chǔ)[2]，一些具有清熱、活血化瘀、解毒及祛腐生肌功效的傳統(tǒng)中藥被用于治療皮膚潰瘍，其機制與調(diào)節(jié)細胞的生長和對局部感染的控制、改善皮膚傷口感染局部微環(huán)境[3-4]。在貴州民間，常將P.petiolosa常用于治療皮膚的燒傷、止血、傷口預(yù)防感染、加快傷口恢復(fù)的金瘡藥，效果良好[5]，但關(guān)于P.petiolosa治療皮膚傷口愈合作用機制的研究鮮有報告。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在創(chuàng)傷后皮膚組織中的表達量有所增加，其表達的時程變化與微小血管形成有一定的一致性， TGF-β對皮膚新生血管的形成有一定的影響作用，對促進皮膚傷口愈合也起著重要作用[6]，TGF-β中的TGF-β1主要發(fā)揮加快膠原沉積、加速創(chuàng)面愈合來促進病理瘢痕的形成[1]。本研究將P.petiolosa孢子葉粉末水提物用于皮膚全層切除傷的小鼠動物模型，觀察用藥后不同時點創(chuàng)緣組織TGF-β1的變化，探究P.petiolosa對皮膚傷口愈合的作用及機制，報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 90只健康的SPF級(specific pathogen free，SPF) 雄性小鼠，體質(zhì)量(20±3)g，購買自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，批號SCXK(黔)2018-001；P.petiolosa采購于貴州本地，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室鑒定；云南白藥粉末購于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、第二抗體試劑SP-9002試劑盒、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TGF-β1 抗體購自上海江林生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器 石蠟切片機(德國萊卡RM2015)；低溫冰箱(日本三洋MDF-382E型)；離心機(德國Eppendorf-5430)；水平電泳槽DYY-Ⅲ 31D、DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一)；高速粉碎機(浙江永康市溪岸五金藥具廠)；TSJ-SD 電腦自動組織脫水機(江蘇省常州市中威電子儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1有柄石韋水提物制備 從有柄石韋葉中刮下孢子粉末，采用100目粉碎機粉碎孢子葉；將有柄石韋孢子與雙蒸水以1 ∶10的比例混合，置于水浴箱中，100 ℃ 8 h，得到有柄石韋孢子葉水提液。

1.2.2小鼠皮膚全層切除傷模型構(gòu)建 90只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機均分為空白組，有柄石韋組和云南白藥組。所有小鼠均采用腹腔注射麻醉(注射3%戊巴比妥鈉)，刮凈小鼠背部毛發(fā)，利用皮膚活檢器和剪刀在每只小鼠的背部脊柱正中做1 cm×1 cm大小的全層皮膚切除傷口制作皮膚全層切除傷模型；造模后云南白藥組小鼠給予云南白藥粉末處理傷口，有柄石韋組小鼠采用有柄石韋粉末水提物處理傷口，空白組僅給予生理鹽水處理3組均連續(xù)治療5 d(1次/d)。各組于手術(shù)當(dāng)日，術(shù)后第3、7、14及18天取出2只小鼠，測算傷口縮小比例.每組剩余的20只小鼠分別于給藥完成后的第3、7、14及18 天分4批次處死，取創(chuàng)緣周圍組織蘇木精—伊紅 (hematoxylin-eosin，HE)染色觀察創(chuàng)緣組織愈合情況。

1.2.3小鼠傷口縮小比例 術(shù)后第3、7、14及18 天拍攝傷口面積，參考文獻[1]計算創(chuàng)面愈合率，評價傷口恢復(fù)的情況。傷口愈合率=[(傷口初始面積-治療后傷口面積)/傷口初始面積]×100%。

1.2.4創(chuàng)緣組織HE染色 于相應(yīng)時間點取每組小鼠的創(chuàng)緣組織，處理干凈皮膚組織上的毛發(fā)，采用10%的中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水后，使用二甲苯溶液透明和包埋皮膚組織塊；切片厚5 μm并HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果[7]。

1.2.5創(chuàng)緣組織的TGF-β1表達 采用Western blot方法，取皮膚創(chuàng)緣組織于RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解緩沖液中裂解。裂解產(chǎn)物在12 000 r/min下離心10 min，收集上清液。用BCA檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。然后負載40 μg蛋白質(zhì)樣品/泳道，進行SDS-PAGE電泳90 min(80 V在濃縮膠中，120 V在分離膠中)。200 mA恒流90 min，用濕式轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉在室溫下密封2 h，并與第一抗體在4 ℃通宵培養(yǎng)。用TBST清洗3次，10 min/次，在室溫下用IgG-HRP 2培養(yǎng)2 h。按照1 ∶1的比例制備ECL化學(xué)發(fā)光液；然后將PVDF膜放置在曝光板上進行顯影和固定，并使用全自動熒光和可見光凝膠成像分析儀進行曝光分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠傷口縮小比例

結(jié)果顯示，云南白藥組和有柄石韋組小鼠傷口在第3、7、14及18天時的縮小比例均大于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；有柄石韋組在第3、7、14及18天時的傷口縮小比例均小于云南白藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠術(shù)后不同時間點創(chuàng)面愈合率比較Tab.1 Comparison of wound healing rate in different periods of wound

2.2 創(chuàng)緣組織愈合情況

如圖1所示，建模后第3天，云南白藥組和有柄石韋組小鼠傷口處的肉芽組織較規(guī)則且厚實，而空白組小鼠傷口處肉芽組織顯得菲薄和不規(guī)則；建模后第7天，云南白藥組和有柄石韋組小鼠傷口處的肉芽組織繼續(xù)生長、相比第3天厚度有所增加、較為緊湊、無水腫現(xiàn)象，而空白組小鼠傷口處相對無明顯變化；建模后第14天時3組的變化則更明顯，建模后第18天，則3組的傷口基本愈合，與空白組相比，云南白藥組和有柄石韋組的愈合后的組織在鏡下顯得更為緊致、無水腫現(xiàn)象、且出現(xiàn)較多的毛囊和皮脂腺。

圖1 術(shù)后第3、7、14及18天時各組小鼠皮膚創(chuàng)緣組織愈合情況(HE, ×400)Fig.1 Results of HE staining of skin wound tissues of mice in each group on the 3rd, 7th, 14th, and 18th days after operation(HE, ×400)

2.3 皮膚創(chuàng)緣組織的TGF-β1蛋白表達

如圖2所示，建模后第3天時，TGF-β1蛋白表達水平開始升高，第7天時到達峰值，第14天開始有明顯下降趨勢。第3、7及14天時，云南白藥組與有柄石韋組的TGF-β1蛋白的相對表達量均較高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第18天時，3組小鼠創(chuàng)緣組織TGF-β1蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：1～3泳道為第3天，4～6泳道為第7天，7～9泳道為第14天，10～12泳道為第18天，1、4、7及10泳道為空白對照組，2、5、8及11泳道為有柄石韋組，3、6、9及12泳道為云南白藥組；(1)與空白對照組比較，P<0.05；(2)與有柄石韋組比較，P<0.05。圖2 術(shù)后第3、7、14及18天時各組小鼠皮膚創(chuàng)緣組織TGF-β1蛋白表達Fig.2 Expression level of TGF-β1 protein in the skin wound tissue of each group on the 3rd, 7th, 14th, and 18th days after operation

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，傷口的愈合是一個涉及多細胞參與的過程，包括角質(zhì)細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和血小板等的共同作用，這些細胞對TGF-β都有很高的反應(yīng)性[7-8]。TGF-β參與了皮膚愈合的炎癥期、肉芽組織期和瘢痕形成期全過程[9-12]。血小板脫顆粒釋放至創(chuàng)緣，在TGF-β的趨化作用下，單核細胞和中性粒細胞到達傷口，以自分泌方式維持局部濃度。TGF-β也可通過趨化作用于成纖維細胞，刺激纖維黏連蛋白和膠原基因的轉(zhuǎn)錄等[13]，通過調(diào)節(jié)蛋白酶的表達抑制基質(zhì)降解，促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，加速傷口收縮[14-15]。雖然有報道稱TGF-β不是唯一的促進傷口愈合的生長因子，但至少也是最重要的調(diào)控和抑制表皮增殖的因素[16-17]。

研究表明，中藥對臨床創(chuàng)面的修復(fù)都有著一定的效果[4]。云南白藥作為我國傳統(tǒng)中藥，可以顯著縮短創(chuàng)口的出血時間及凝血時間[18-19]，被廣泛用于治療臨床創(chuàng)傷出血、消化道出血等疾病[20]。在貴州民間，常將P.petiolosa常用于治療皮膚的燒傷、止血、傷口預(yù)防感染、加快傷口恢復(fù)的金瘡藥，使用效果良好[5]，但關(guān)于P.petiolosa治療皮膚傷口愈合作用機制的研究鮮有報告。本研究以云南白藥為陽性對照，從TGF-β1的角度對P.petiolosa促進傷口愈合機制進行初步探究。結(jié)果表明，云南白藥組和有柄石韋組的傷口縮小比例均大于同期空白對照組(P<0.05)。提示云南白藥組和有柄石韋組組織中肌成纖維細胞生成迅速，這些細胞產(chǎn)生機械拉力，將創(chuàng)緣向創(chuàng)口中心牽引，促使傷口快速收縮。提示有柄石韋在促進傷口愈合上有積極作用。HE染色下，云南白藥組和有柄石韋組的肉芽組織較空白對照組緊致厚實，成纖維細胞和纖維細胞豐富，空白對照組相對菲薄疏松。術(shù)后第18天有柄石韋組和云南白藥組的切片顯示傷口上皮化完全，提示愈合較為完全，愈合程度較好。Western blot結(jié)果也顯示，建模后第3天時，TGF-β1蛋白表達水平開始升高，第7天時到達峰值，第14天開始有明顯下降趨勢。第3、7及14天時，云南白藥組與有柄石韋組的TGF-β1蛋白的相對表達量均較高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第18天時，3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示有柄石韋組傷口組織TGF-β1分泌量介于空白對照組和云南白藥組，利于傷口皮膚愈合的炎癥期、肉芽組織期和瘢痕形成期的進行，對促進傷口愈合有積極作用。

綜上所述，傷口修復(fù)是一種常見的病理過程。本研究結(jié)果表明，有柄石韋促進傷口愈合的機制可能是通過刺激TGF-β1的表達使傷口修復(fù)的炎癥期、肉芽組織期和瘢痕形成期加快，促進成纖維細胞和巨噬細胞的募集，進一步釋放更多的生長因子，加速創(chuàng)面再上皮化。促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞，加速創(chuàng)口中心對創(chuàng)緣的牽拉作用，加速傷口的縮小，加速創(chuàng)面愈合。