潘禮業(yè)，索彩仙，邱韻靜，吳佳璇，吳文平，李國衛(wèi)

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

石韋始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，用藥歷史悠久[1]。石韋為水龍骨科植物水龍骨科植物廬山石韋Pyrrosiasheareri(Baker) Ching、有柄石韋Pyrrossiapetiolosa(Christ)Ching、石韋Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell的干燥葉，味甘苦，微寒，歸肺、膀胱經(jīng)，具利尿通淋、清肺止咳、涼血止血功效[2]。有柄石韋分布在全國大部分地區(qū)，主產(chǎn)于四川、湖北、貴州等省[3]。其他常見石韋地方習(xí)用品有華北石韋Pyrrosiadavidii(Baker) Ching，收載于地方標(biāo)準(zhǔn)[4]。據(jù)文獻(xiàn)報道，有柄石韋中主要含有三萜、黃酮類化合物、萜酮類、酚酸類等成分[3]。

目前，針對石韋的產(chǎn)地及基原研究較少[5-7]，而以HPLC指紋圖譜對其質(zhì)量進(jìn)行評價也主要是針對不同產(chǎn)地或基原藥材進(jìn)行樣品間的對比分析，并未深層次的探討不同產(chǎn)地或基原藥材樣品之間差異的內(nèi)在因素，而且石韋中酚酸類成分多，含量差異大，部分酚酸類成分的性質(zhì)比較接近，利用常規(guī)的HPLC很難實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、高效的分離與檢測。UPLC法具有更強(qiáng)大的分離能力、超快的分離速度及超高的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，同時在縮短分析時間及減少試劑消耗方面也具有很大的應(yīng)用前景。本研究擬通過對不同產(chǎn)地有柄石韋進(jìn)行研究，建立有柄石韋超高效液相特征圖譜，對有柄石韋、石韋、廬山石韋和華北石韋進(jìn)行系統(tǒng)區(qū)分，并嘗試對體現(xiàn)其差異性的內(nèi)在因素進(jìn)行探討，為有柄石韋藥材的質(zhì)量控制提供更科學(xué)的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters H-Class高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；Waters CORTECS T3(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)色譜柱；ME204E萬分之一分析天平、XP-26百萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500D數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)(美國默克股份有限公司)。

綠原酸對照品(批號：110753-201817；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.8%)、咖啡酸對照品(批號：110885-201703；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.7%)為中國食品藥品檢定研究院提供；隱綠原酸對照品(批號：1512701；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%)為成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；新綠原酸對照品(批號：wkq18030107；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%)、異綠原酸C對照品(批號：wkq1805905；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%)為四川省維克奇生物科技有限公司提供；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

樣品經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為水龍骨科植物廬山石韋Pyrrosiasheareri(Baker) Ching、有柄石韋Pyrrossiapetiolosa(Christ)Ching、石韋Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell、華北石韋Pyrrosiadavidii(Baker) Ching的干燥葉，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；以甲醇為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，7%→15%A；15～18 min，15%→20%A；18～25 min，20%→25%A；25～30 min，25%A；30～35 min，25%→40%A；35～40 min，40%→80%A；40～45 min，80%A)；流速為0.35 mL/min；檢測波長為326 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 對照品溶液的配制

取新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為61.41、17.60、200.11、61.51、54.12 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末(過二號篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(300 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品(S1)溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸為參照峰，計算得各主要成分相對峰面積RSD值為0.15%～3.15%，相對保留時間RSD值為0.02%～0.17%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品(S1)溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，以綠原酸為參照峰，計算得各主要成分相對峰面積RSD值為0.26%～3.38%，相對保留時間值RSD為0.04%～0.26%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(S1)的有柄石韋樣品6份，每份約0.5 g，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，以綠原酸為參照峰，計算得各主要成分相對峰面積RSD值為0.22%～1.42%，相對保留時間RSD值為0.05%～0.20%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜建立與分析

2.5.1 特征圖譜建立與特征峰歸屬 取20批有柄石韋藥材，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，分別得到20批樣品的特征圖譜，以CDF格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)軟件，以S1藥材作為參照圖譜，將時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，以平均數(shù)法作為共有模式圖生成方式，運(yùn)用多點(diǎn)校正方法，對20批樣品的色譜峰進(jìn)行手動Mark峰的匹配，建立有柄石韋特征圖譜共有模式，得到9個共有峰，結(jié)果見圖1。通過與對照品進(jìn)行對比，可以確定峰1為新綠原酸，峰3為咖啡酸，峰4為綠原酸，峰5為隱綠原酸，峰9為異綠原酸C，結(jié)果見圖2。以峰4綠原酸為參照峰S，20批有柄石韋藥材特征圖譜的其他9個特征峰相對保留時間RSD值在0.08%～2.86%內(nèi)，相對峰面積的RSD值在14.64%～46.65%內(nèi)(見表2)，表明不同產(chǎn)地有柄石韋藥材的特征峰對應(yīng)成分在含量上存在一定波動。

圖1 20批有柄石韋藥材的特征UPLC圖譜

A.混合對照品；B.供試品；1.新綠原酸；3.咖啡酸；4.綠原酸；5.隱綠原酸；9.異綠原酸C。

表2 20批有柄石韋藥材特征圖譜的相對峰面積

2.5.2 相似度分析 根據(jù)國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)軟件，分析了20批不同產(chǎn)地的有柄石韋藥材的相似度，結(jié)果見表3?？梢?，20批有柄石韋特征圖譜的相似度范圍在0.982～1.000，表明不同產(chǎn)地的有柄石韋具有較高的相似度，說明有柄石韋整體質(zhì)量穩(wěn)定，具有很好的一致性。

表3 有柄石韋藥材特征圖譜相似度結(jié)果

2.5.3 系統(tǒng)聚類分析 運(yùn)用SPSS 22.0軟件對20批有柄石韋進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以歐氏距離平方和為維度，分析結(jié)果見圖3。可見，當(dāng)判斷距離為10時，20批有柄石韋被分為2類：S1～S3、S8～S10、S14～20聚為一類，即重慶與貴州的樣品聚為一類；S4～S6、S11～S13聚為一類，即四川廣元樣品為一類。當(dāng)歐氏距離為5時，20批藥材被分為4類：Ⅰ類包括S1～S3、S7、S14、S15、S17，即重慶產(chǎn)樣品與1批貴州樣品聚為一類；Ⅱ類包括S8～S10、S16、S18～S20，即貴州與一批重慶聚為一類；Ⅲ類包括S4～S6，即四川青川聚為一類；Ⅳ類包括S11～S13，即四川旺蒼聚為一類。除S7、S16外，其余聚類結(jié)果與產(chǎn)地分布相符，表明產(chǎn)地氣候環(huán)境對所產(chǎn)藥材質(zhì)量有一定影響，S7、S16的差異可能為產(chǎn)地采收加工等因素導(dǎo)致。

2.5.4 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 依據(jù)聚類分析結(jié)果，對不同產(chǎn)地的5組樣品進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果見圖4?？梢姡揚(yáng)LS-DA模型，R2X(cum)=0.979，R2X(cum)=0.81，Q2(cum)=0.501，均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠，可用于不同產(chǎn)地石韋樣品的區(qū)分；數(shù)據(jù)的分類算法中PLS-DA的效果較好，可使5種樣本點(diǎn)完全被分開，相互之間未出現(xiàn)交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區(qū)間之內(nèi)。采用變量重要性投影值(variable importance in project，VIP)篩選體現(xiàn)5個不同產(chǎn)地樣品質(zhì)量差異的標(biāo)志物，其中VIP值大于1的成分包括5個，分別為峰1(新綠原酸)、峰2、峰3(咖啡酸)、峰8、峰9(異綠原酸C)，這些成分是體現(xiàn)5個不同產(chǎn)地有柄石韋樣品間成分差異的主要標(biāo)志性成分，其余峰VIP值小于1，對樣品的區(qū)分影響較小，結(jié)果見圖5。

圖3 聚類分析結(jié)果

圖4 PLS-DA得分圖

2.5.5 特征圖譜的應(yīng)用 取廬山石韋S24-S28和S31、華北石韋S21-S23和S30、石韋S29，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，得到圖6-圖8。結(jié)果顯示，石韋的4個基原(石韋、有柄石韋、廬山石韋、華北石韋)的特征圖譜具有明顯差異。6批廬山石韋的特征圖譜表明，不同地區(qū)廬山石韋間的特征圖譜具有共性，其圖譜重合度較高；同樣，4批華北石韋的特征圖譜共性明顯，重合度較高。有柄石韋具有11個共有峰，華北石韋有16個共有峰，廬山石韋有13個共有峰，石韋有12個共有峰，不同石韋基原間的共有峰差異較大，峰1(新綠原酸)、峰2、峰4(綠原酸)、峰5(異綠原酸)為不同基原的共有成分。不同基原的石韋樣品中，華北石韋的圖譜信息最豐富，峰12～峰19均為華北石韋的獨(dú)有成分；有柄石韋的成分最簡單，峰30為其獨(dú)有成分；峰20～峰26為廬山石韋的獨(dú)有成分；峰27～峰29為石韋的獨(dú)有成分；另外，峰10為有柄石韋、華北石韋、廬山石韋的共有成分，基原為石韋的樣品中未檢測出該成分；峰3為有柄石韋、華北石韋的共有成分，基原為廬山石韋、石韋的樣品中未檢測出該成分。

圖5 8個化學(xué)成分的VIP值

圖6 6批廬山石韋UPLC特征圖譜

圖7 4批華北石韋UPLC特征圖譜

A.有柄石韋; B.華北石韋; C.廬山石韋; D.石韋

3 討論

3.1 分析方法的優(yōu)化

比較了乙醇、70%乙醇、稀乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇6種提取溶劑，結(jié)果顯示甲醇、乙醇、70%乙醇作為提取溶劑時，峰形較差，70%甲醇、50%甲醇、稀乙醇的提取效果較接近，結(jié)合色譜峰的總特征峰與稱樣量比值、色譜峰分離效果結(jié)果來看，最終選取50%甲醇作為提取溶劑。比較不同檢測波長，結(jié)果顯示在326 nm波長下，色譜基線噪音比較低，特征響應(yīng)值較高，色譜信息比較完全，故選擇326 nm作為檢測波長。

3.2 特征圖譜的分析

本研究通過建立了20批不同產(chǎn)地的有柄石韋藥材的超高效液相特征圖譜，超高效液相與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比分析時間較短，提高了效率，特征圖譜不僅能夠在一定程度上反映有柄石韋的整體性，也能反映出其特異性；通過相似度評價分析得到20批藥材特征圖譜相似度均>0.98，各產(chǎn)地間亦均表現(xiàn)出很高的相似度，說明藥材質(zhì)量總體較為穩(wěn)定，能反映產(chǎn)地真實(shí)情況；聚類分析結(jié)果顯示樣品基本可以按產(chǎn)地進(jìn)行聚類，個別批次未與產(chǎn)地聚類，或因受采收加工影響導(dǎo)致；偏最小二乘判別分析與聚類分析，能互相支持佐證，不同地區(qū)的有柄石韋整體表現(xiàn)出很高的相似性，且具有各自內(nèi)在的區(qū)別。

3.3 不同基原樣品的比較

本研究在建立有柄石韋特征圖譜的基礎(chǔ)上，對4種不同基原的石韋樣品進(jìn)行了比較，通過圖譜的直觀分析，可以明顯區(qū)分不同石韋基原。其中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸為不同石韋基原樣品的共有成分，提示酚酸類成分可能為不同基原石韋藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，可能也是導(dǎo)致不同石韋基原的藥理藥效一致的因素。但不同基原的石韋樣品其特征圖譜差異較大，華北石韋與2015年版《中國藥典》上收載的3個基原(石韋、有柄石韋、廬山石韋)區(qū)別明顯，成分最為豐富，具有16個共有峰，8個特有成分?！吨袊幍洹肥蛰d的3個法定基原中，石韋和有柄石韋則表現(xiàn)出較高的相似性，具有8個共有峰，有柄石韋中僅有2個成分在石韋中未檢出，石韋中則有4個成分在有柄石韋中未檢出；廬山石韋則在15 min后的圖譜中表現(xiàn)出與石韋及有柄石韋的明顯差異。據(jù)文獻(xiàn)報道，石韋與有柄石韋2個基原的性狀較為接近，廬山石韋則在性狀則與前兩者具有較大差異[6]，結(jié)合本研究的結(jié)果，說明這3個基原的性狀差異與成分差異具有高度的一致性。

本研究通過在建立有柄石韋特征圖譜的基礎(chǔ)上，對不同基原的石韋樣品進(jìn)行了對比分析，其結(jié)果科學(xué)、可靠，為石韋藥材的質(zhì)量研究提供了新方法。本研究僅對不同基原石韋的樣品進(jìn)行了對比分析，并未對其差異成分進(jìn)行確證，下一步可通過LC-MS/MS技術(shù)對不同基原石韋的差異成分進(jìn)行研究，進(jìn)一步揭示不同基原石韋的差異物質(zhì)基礎(chǔ)。