左銀龍，周 易，黃珍谷，陳興華

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院大足醫(yī)院，重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院骨科，重慶 402360)

骨肉瘤是骨骼系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童以及青少年，約占小兒惡性腫瘤的5%。目前骨肉瘤的主要治療方式有手術(shù)切除和術(shù)后化療[1]，患者長(zhǎng)期無(wú)瘤生存率約為65%～70%[2]。但是，骨肉瘤較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其易向肺部轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)[3]，約10%～20%的患者在確診時(shí)已發(fā)生了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。骨肉瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存率將明顯降低，其中肺轉(zhuǎn)移患者5年生存率僅約為30%[2-3]。骨肉瘤的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，染色體異常、基因表達(dá)異常及突變、表觀遺傳(DNA甲基化、組蛋白乙?；?、非編碼RNA等)異常等均與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4-8]。近來(lái)研究[9]表明，間充質(zhì)細(xì)胞分化異常及障礙也是骨肉瘤發(fā)生的重要原因。

Runt域轉(zhuǎn)錄因子X(Runx)是一類高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，在器官發(fā)育、組織形成、細(xì)胞增殖代謝、干細(xì)胞定向分化以及腫瘤發(fā)生中均發(fā)揮著重要的作用[10]。Runx家族包括Runx1、Runx2和Runx3 3個(gè)成員，其中，Runx1參與調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的分化和成熟[11]，Runx2在骨骼發(fā)育中至關(guān)重要[12]，而Runx3控制背根神經(jīng)節(jié)的發(fā)生及精密調(diào)控腸道的發(fā)育[13-14]，也可作為一種抑癌基因，調(diào)控胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌等的發(fā)生[15-18]。但Runx3在骨肉瘤中的具體作用及其分子機(jī)制尚未明確。本研究以骨肉瘤細(xì)胞143B為細(xì)胞模型，利用過表達(dá)和RNA干擾Runx3的重組腺病毒質(zhì)粒，觀察Runx3對(duì)143B細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響，并探討Runx3對(duì)PI3K/AKT和MAPKs通路的影響，為闡明骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒

人骨肉瘤細(xì)胞株143B、MG63、SaoS2和人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)購(gòu)自美國(guó)ATCC；過表達(dá)Runx3的腺病毒重組質(zhì)粒(Ad-Runx3)、Runx3的RNA干擾腺病毒重組質(zhì)粒(Ad-siRunx3)和對(duì)照腺病毒質(zhì)粒(NC)均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行構(gòu)建和擴(kuò)增。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)液、鏈霉素和青霉素購(gòu)自Gibco公司；MTT試劑購(gòu)自北京索萊寶公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)自Millipore公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購(gòu)自Takara公司；一抗Runx3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、p-p38、p-38、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin，HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

143B、MG63、SaoS2和hMSCs細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，DMEM高糖完全培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

143B細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組(Blank)、陰性對(duì)照組(NC)、Runx3干擾組(Ad-siRunx3)、Runx3過表達(dá)組(Ad-Runx3)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)

143B細(xì)胞按500 個(gè)·孔-1接種于96孔板，培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞貼壁后按預(yù)定分組分別處理24、48和72 h，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后，加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，放置孵箱孵育4 h，取出孔板并棄上清，每孔加入100 μL DMSO，避光室溫震蕩10 min，在492 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔OD值。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

143B細(xì)胞按500 個(gè)·孔-1接種在6孔板中，添加各種處理因素并培養(yǎng)7 d。棄培養(yǎng)基，PBS洗2次。4%多聚甲醛固定10 min，加入結(jié)晶紫染液每孔0.1 mL，室溫中靜置染色20 min。去染色液，自然干燥，最后掃描成像，利用Image J軟件計(jì)數(shù)集落形成數(shù)目(直徑大于0.3 mm計(jì)為一個(gè)集落)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

143B細(xì)胞(3×105孔-1)在6孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為90%以上。用10 μL槍頭在細(xì)胞上劃線從而人為制造劃痕，劃痕0 h和16 h后顯微鏡下(×40)拍照記錄，并進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞遷移率=(0 h寬度-16 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

將30 μL基質(zhì)膠稀釋液(基質(zhì)膠原液:DMEM培養(yǎng)基=1:5)均勻鋪于小室，隨后將小室放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中至基質(zhì)膠完全凝固。小室內(nèi)加入500 μL 143B細(xì)胞懸液(6×104個(gè)·mL-1)，細(xì)胞貼壁后，Ad-siRunx3、Ad-Runx3和NC腺病毒進(jìn)行感染。小室放入24孔板繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS沖洗小室2遍，隨后4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染液染色10 min，并充分干燥。顯微鏡下(×100)計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 RT-qPCR

用對(duì)照腺病毒(NC)、Ad-siRunx3和Ad-Runx3分別感染143B細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件為 95 ℃變性5 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列

1.2.7 Western blot

將143B細(xì)胞接種于T-24培養(yǎng)瓶中(106個(gè)·瓶-1)，細(xì)胞貼壁后施加不同處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，裂解細(xì)胞提取總蛋白，隨后利用SDS-PAGE對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離。電泳完畢后，利用濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST(5%BSA)封閉1 h，一抗4 ℃過夜，TBST洗3次，加入HPR標(biāo)記二抗，37 ℃條件下孵育1 h，隨后ECL顯影、成像和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)對(duì)組間兩兩之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的篩選及Ad-siRunx3和Ad-Runx3在143B細(xì)胞中有效性的驗(yàn)證

Western blot結(jié)果顯示，與hMSCs細(xì)胞相比，3種人骨肉瘤細(xì)胞株Runx3的表達(dá)均降低，且143B細(xì)胞中Runx3的表達(dá)介于其他2種人骨肉瘤細(xì)胞之間(圖1A)，故后續(xù)選擇143B細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，與NC組細(xì)胞比較，Ad-siRunx3組143B細(xì)胞中Runx3蛋白表達(dá)下調(diào)，Ad-Runx3組143B細(xì)胞中Runx3蛋白上調(diào)，而NC組與Blank組細(xì)胞比較，Runx3蛋白水平無(wú)明顯差異。見圖1B。這些結(jié)果表明重組腺病毒質(zhì)粒Ad-siRunx3和Ad-Runx3表現(xiàn)了良好的效果。

2.2 Runx3對(duì)143B細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，Runx3表達(dá)下調(diào)時(shí)，143B細(xì)胞的增殖能力在24、48和72 h均較Blank和NC組更強(qiáng)，而過表達(dá)RUNX3時(shí)，143B細(xì)胞的增殖能力在24、48和72 h均較Blank和NC組更弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2A)。同時(shí)，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Blank和NC組比較，Runx3表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)143B細(xì)胞的克隆形成能力，而過表達(dá)Runx3可抑制143B細(xì)胞的克隆形成能力，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2B)。這些結(jié)果提示：抑制Runx3表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖，而上調(diào)Runx3表達(dá)則可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

2.3 Runx3對(duì)143B細(xì)胞遷移和侵襲的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Runx3表達(dá)下調(diào)時(shí)，143B細(xì)胞的遷移能力較Blank和NC組更強(qiáng)，而過表達(dá)Runx3時(shí)，143B細(xì)胞的遷移能力較Blank和NC組更弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖3A)。同時(shí)，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Blank和NC組比較，Runx3表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)143B細(xì)胞的侵襲能力，而過表達(dá)Runx3可抑制143B細(xì)胞的侵襲能力，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖3B)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無(wú)論在RNA水平還是蛋白水平，Runx3表達(dá)下調(diào)時(shí)，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)而N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)上調(diào)；過表達(dá)Runx3時(shí)，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)而N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)下調(diào)。見圖4。

2.4 Runx3對(duì)143B細(xì)胞中PI3K/AKT和MAPK信號(hào)關(guān)鍵分子表達(dá)的影響s

PI3K/AKT和MAPKs(p38和ERK1/2)信號(hào)對(duì)骨肉瘤增殖、遷移和侵襲有重要的調(diào)控作用[20-21]?；诖耍狙芯坷肳estern blot分析了Runx3對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B細(xì)胞中PI3K/AKT和MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的影響。

圖5結(jié)果顯示：與Blank組和NC組比較，抑制Runx3表達(dá)時(shí)，AKT在473位絲氨酸(Ser473)和308位蘇氨酸(Thr308)磷酸化，p38和ERK1/2磷酸化水平均增加；反之在過表達(dá)RUNX3時(shí)，AKT在473位絲氨酸(Ser473)和308位蘇氨酸(Thr308)磷酸化及p38和ERK1/2磷酸化水平相應(yīng)減少。

3 討論

骨肉瘤的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，涉及多個(gè)方面的因素。目前的研究顯示骨肉瘤發(fā)病機(jī)理主要包括：基因(癌基因以及原癌基因)突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常、DNA和蛋白質(zhì)的甲基化、組蛋白乙?；icroRNA、lncRNA和間充質(zhì)干細(xì)胞分化障礙等[4-9]，而且各因素之間并非單獨(dú)起作用，相互之間也有密切的關(guān)聯(lián)。Runx3是Runx家族重要成員之一，Runx3除了調(diào)控神經(jīng)和腸道發(fā)育外[13-14]，Runx3也是一種腫瘤抑制因子，可抑制胃癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)在骨肉瘤細(xì)胞143B中抑制Runx3表達(dá)，可增強(qiáng)和促進(jìn)其增殖、遷移和侵襲；而過表達(dá)Runx3則可抑制骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖、遷移和侵襲。有研究[19]表明，EMT可使腫瘤細(xì)胞更具遷移和侵襲能力，而Cadherin(N-cadherin及E-cadherin)家族、Vimentin和Snail則是EMT的重要調(diào)節(jié)關(guān)鍵分子，也是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要誘導(dǎo)因子[20-22]。靶向抑制EMT關(guān)鍵分子，可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲：如miR-410-3p可通過靶向抑制Snail從而延緩乳腺癌的進(jìn)展；鳶尾素則通過下調(diào)Vimentin和Snail表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞A549和NCI-H446的遷移、侵襲[23-24]。而本研究通過RT-qPCR和Western blot方法證實(shí)：抑制Runx3表達(dá)可使E-cadherin表達(dá)降低，但使N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)增加；反之，過表達(dá)Runx3可促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，但抑制N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)。這些結(jié)果提示：Runx3可能通過調(diào)控E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)而影響EMT進(jìn)程，進(jìn)而影響骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲。

在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中，PI3K/AKT信號(hào)及MAPKs信號(hào)發(fā)揮著重要作用，在多種腫瘤包括骨肉瘤中往往伴有AKT、p38和ERK1/2的活化[25-29]。本研究也發(fā)現(xiàn)，抑制Runx3表達(dá)時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)及MAPKs信號(hào)活化增強(qiáng)，導(dǎo)致AKT、p38和ERK1/2磷酸化增加，當(dāng)過表達(dá)Runx3時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)及MAPKs信號(hào)活化減弱，使得AKT、p38和ERK1/2磷酸化降低。這些結(jié)果表明，Runx3可能通過抑制骨肉瘤細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)及MAPKs信號(hào)的活化，從而發(fā)揮抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在骨肉瘤中Runx3發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用，下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤143B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而上調(diào)其表達(dá)可抑制143B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；而且，這可能與Runx3調(diào)節(jié)143B細(xì)胞中PI3K/AKT及MAPKs信號(hào)途徑的活性，影響EMT標(biāo)志分子的表達(dá)有關(guān)。后續(xù)將收集臨床骨肉瘤標(biāo)本，分析Runx3與骨肉瘤臨床病理參數(shù)(如惡性程度、轉(zhuǎn)移、生存期等)的關(guān)系，探索其作為骨肉瘤診斷標(biāo)志物的可行性，同時(shí)進(jìn)一步解析Runx3是否還可通過其他信號(hào)途徑如Wnt/β-catenin、NF-кB信號(hào)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)揮作用。