方若思 周澄笑 金誠(chéng)豫 張一維 黃溫迪 黃 俊 呂常江 肖功年 龔金炎 陳啟和

（1 浙江科技學(xué)院 杭州310023 2 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310023 3 浙江大學(xué) 杭州310058）

鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶（OTCase/OTC，EC 2.1.3.3） 是瓜氨酸合成代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，廣泛存在于動(dòng)、植物與微生物中，分布于生物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段。在原核生物和真菌中，OTCase 是一種雙功能酶，不僅可催化瓜氨酸的合成，也催化瓜氨酸的降解[1-2]；在植物中，它是尿素循環(huán)第1 步反應(yīng)的催化酶，催化鳥(niǎo)氨酸和氨甲酰磷酸反應(yīng)合成瓜氨酸和磷酸鹽[3]；在動(dòng)物中，OTCase 主要參與尿素循環(huán)，是尿素循環(huán)的關(guān)鍵酶之一；在人體內(nèi)，OTCase是肝臟尿素循環(huán)的必需酶，OTCase 的缺失常導(dǎo)致嗜睡、嘔吐、精神發(fā)育遲緩等癥狀，同時(shí)OTCase的缺失與否也可作為肝細(xì)胞癌的早期診斷指標(biāo)之一[4-5]。

鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶參與乳酸菌精氨酸代謝途徑的關(guān)鍵一步，即將瓜氨酸分解成為鳥(niǎo)氨酸和氨甲酰磷酸。瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，因最先從西瓜中獲取而得名[6]。研究表明，瓜氨酸對(duì)于男性性功能障礙、高血壓和冠心病具有一定療效，并可作為人體NO 產(chǎn)生的評(píng)價(jià)因子，且在腦血流的調(diào)節(jié)，提高身體免疫力和美容護(hù)膚中具有重要的作用[7-10]。

除上述優(yōu)點(diǎn)外，瓜氨酸也是發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的重要前體物[11-12]。氨基甲酸乙酯（簡(jiǎn)稱(chēng)EC，又稱(chēng)脲烷），是一種在試驗(yàn)動(dòng)物甚至人體內(nèi)造成多位點(diǎn)致癌的物質(zhì)，2007年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定EC 為2A 類(lèi)致癌物質(zhì)，與丙烯酰胺同等危險(xiǎn)。EC 存在于多種發(fā)酵食品，尤其是發(fā)酵的酒精飲料中，如葡萄酒、黃酒、日本清酒等[13-14]。

酒類(lèi)中的瓜氨酸主要來(lái)自精氨酸降解。在乳酸菌中，精氨酸的降解通過(guò)精氨酸脫亞胺酶途徑（arginine deiminase pathway，ADI pathway）完成。在這一途徑中，包含3 個(gè)關(guān)鍵酶：精氨酸脫亞胺酶（ADI，arginine deiminase，EC 3.5.3.6）、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶 （OTC，ornithine transcarbamylse，EC 2.1.3.3） 和氨基甲酸激酶（CK，carbamatekinase，EC 2.7.2.2）[15]，它們分別由arcA、arcB 和arcC 基因編碼[16]，如圖1所示。

圖1 乳酸菌中精氨酸的代謝途徑Fig.1 Arginine metabolic pathway in LAB

目前，對(duì)精氨酸脫亞胺酶的研究較為透徹，而對(duì)鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的研究仍為空白。尋找更加安全有效的OTCase 具有重要的研究?jī)r(jià)值。

乳桿菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，在含碳水化合物的動(dòng)物及植物發(fā)酵產(chǎn)品以及溫血類(lèi)動(dòng)物的消化系統(tǒng)中十分常見(jiàn)，作為一般認(rèn)為安全（Generally recognized as safe，GRAS）的食品級(jí)微生物，在食品、工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域中亦擁有重要的應(yīng)用價(jià)值。挖掘益生性乳酸菌源的各種酶類(lèi)是目前人們的關(guān)注點(diǎn)之一。短乳桿菌（Lactobacillus brevis） 是乳桿菌屬中一種非常重要的菌種，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示短乳桿菌中無(wú)疑存在著具有生物活性的OTCase。獲取并研究短乳桿菌的OTCase 酶學(xué)性質(zhì)，將為探索其應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 短乳桿菌（Lactobacillus brevis），由浙江大學(xué)食品微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌BL21（DE3），購(gòu)自全試金公司；質(zhì)粒pET-28a，由浙江科學(xué)院保存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、L-精氨酸、DL-鳥(niǎo)氨酸、茚三酮、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan）、Ni-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、SalI，購(gòu)自TaKaRa 公司，

1.1.3 培養(yǎng)基

1）LB 培養(yǎng)基 酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

2）MRS 培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉5 g/L，酵母浸粉4 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三胺2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，pH 6.2，用于短乳桿菌的培養(yǎng)。

1.2 鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的克隆

短乳桿菌鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的正向引物序列：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAA AATGTA-3’（下劃線(xiàn)為BamHI 識(shí)別序列）；反向引物 序 列：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAA TAAGTTACCT-3’（下劃線(xiàn)為SalI 識(shí)別序列）。以短乳桿菌的基因組DNA 為模板，進(jìn)行鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的基因擴(kuò)增，反應(yīng)程序：98 °C 變性5 min，以98°C 20 s，55°C 15 s，72°C 20 s 反應(yīng)35個(gè)循環(huán)后，72 °C 延伸7 min，最后冷卻至4 °C。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

采用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI 和SalI 分別對(duì)鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因片段和載體pET-28a 進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含卡那霉素的LB 培養(yǎng)平板上，經(jīng)菌落PCR 驗(yàn)證后，篩選得到陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆子DNA 后測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

挑取陽(yáng)性單菌落接種于5 mL LB 培養(yǎng)基中，于37°C、200 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接于200 mL LB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)于37°C、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，至OD600nm值在0.6～0.8時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），25°C、180 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜。

離心、收集菌體后，加入30 mL 緩沖液 （50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑pH 8.0） 重懸菌體，隨后冰水浴超聲破碎細(xì)胞，4°C、9 000/min 離心30 min，獲得上清液。

Ni-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂是螯合金屬Ni2+而形成的一種親和層析介質(zhì)。該純化介質(zhì)對(duì)帶有His-Tag的蛋白有專(zhuān)一的吸附能力，能使His-Tag 蛋白結(jié)合在Ni-NTA 親和層析介質(zhì)上，而沒(méi)有結(jié)合的雜蛋白被洗滌掉。結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)一定濃度的咪唑洗脫下來(lái)，得到高純度的目的蛋白。參照Ni-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂的使用說(shuō)明，采用親和層析純化重組蛋白，隨后用SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白純度及分子質(zhì)量。

1.5 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定[17]

取125 μL 酶液與125 μL 10 mmol/L MnCl2在55 ℃下培養(yǎng)20 min，激活酶，加入250 μL 0.1 mol/L 精氨酸底物（pH 9.5），于37 ℃水解55 min。取樣100 μL，加入300 μL 冰醋酸終止酶反應(yīng)，最后加入100 μL 70 mmol/L 茚三酮進(jìn)行比色測(cè)定，檢測(cè)有無(wú)鳥(niǎo)氨酸形成。煮沸30 min 后測(cè)OD515nm值。根據(jù)鳥(niǎo)氨酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合方程計(jì)算酶液中鳥(niǎo)氨酸含量，蛋白含量采用Brandford 法測(cè)定。OTC 酶活定義為每分鐘水解1 mg 蛋白質(zhì)產(chǎn)生1 μmol 鳥(niǎo)氨酸所需的酶量（OTC）為1 個(gè)酶活單位。

1.6 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶最適溫度的測(cè)定 將酶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入底物，分別置于25，35，45，55，65，75 ℃條件下反應(yīng)，測(cè)定酶活。

1.6.2 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定 將酶液分別置于4，37，60 ℃中保溫放置0，20，40 min，1，2，3 h 后進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定其活性。

1.6.3 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶最適pH 的測(cè)定 配制pH 5.5～11.5 的精氨酸底物，加入酶液，反應(yīng)后測(cè)定酶活。

1.6.4 NaCl 和乙醇對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響 將純化得到的酶液在不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù) （0%，2.5%，5%，10%，15%，18%，20%）的緩沖液中保溫1 h，測(cè)定酶活，確定NaCl 對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響。將純化的酶液在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0%，2.5%，5%，10%，15%，18%，20%）的緩沖液中保溫1 h，測(cè)定酶活，確定乙醇對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響。

1.6.5 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 酶的米氏常數(shù)Km值，即酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度的二分之一時(shí)的底物濃度，是酶的非常重要的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，表示酶與反應(yīng)底物的結(jié)合能力。Km越小，結(jié)合能力越強(qiáng)，反之亦然。在pH 9.5，37 ℃條件下，以精氨酸為底物，分別測(cè)定重組ADI 在底物濃度為0.01～1 mol/L 時(shí)的反應(yīng)速度，然后將試驗(yàn)數(shù)據(jù)按Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法作圖，求出酶的Km和Vmax。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因序列的測(cè)定結(jié)果

將構(gòu)建并鑒定的重組質(zhì)粒交由上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果該序列與短乳桿菌具有100%的相似性，表明重組鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建成功。

2.2 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的分離純化

見(jiàn)圖2。

2.3 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度 溫度對(duì)酶活性的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是溫度升高，提高了分子運(yùn)動(dòng)速率，從而增加了底物分子與酶蛋白的結(jié)合幾率；二是溫度影響酶蛋白分子的結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)易使蛋白變性失活，降低酶分子的催化效率。綜上，溫度對(duì)酶活性的影響是兩個(gè)因素綜合作用的結(jié)果。其它反應(yīng)條件相同，在25～75 ℃范圍，間隔10 ℃測(cè)定不同溫度下的酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的酶活隨溫度的升高而升高，在溫度高于45 ℃后酶活的提高幅度較大，55 ℃時(shí)酶活達(dá)到最高值，隨后急速下降。綜上，此OTC 酶的最適反應(yīng)溫度為55℃。

圖2 重組OTCase 純化SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis for the purified recombinant OTCase

圖3 溫度對(duì)重組OTCase 活性的影響Fig.3 Effects of temperature on activity of the recombinant OTCase

圖4 不同溫度下鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性Fig.4 Stability of the recombinant OTCase at different temperature

2.4 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性

重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶在4 ℃放置3 h后活性差異不大，在37 ℃下放置3 h 仍保持50%以上的生物活性，然而，其在65 ℃下的半衰期僅為10 min，放置40 min 后已檢測(cè)不到活性。

2.5 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的最適pH 值

pH 值對(duì)酶活性的影響主要是酸性或堿性環(huán)境改變酶的空間結(jié)構(gòu)。在其它反應(yīng)條件相同的前提下，在pH 5.5～11.5 范圍測(cè)定酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

如圖5所示，鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶活性隨pH值的變化而變化。當(dāng)pH 5.5～6.5 時(shí)，隨著pH 值的升高，酶活性升高，在pH 6.5 時(shí)酶活性達(dá)到最高值。當(dāng)pH 高于6.5 后，酶活下降，在pH 11.0時(shí)，酶活力僅為最高值的1/6，表明此酶為酸性偏中性酶。

2.6 NaCl 和乙醇對(duì)重組鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶活性穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵食品和飲料酒中普遍存在 NaCl 和乙醇，例如醬油中NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%左右，黃酒、葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%～15%?？疾霴TC酶對(duì)鹽和乙醇的耐受性，有利于為其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供參考。

圖5 pH 值對(duì)重組OTCase 活性的影響Fig.5 Effects of pH on activity of the recombinant OTCase

如圖6可知，OTC 酶的活性隨著乙醇、NaCl濃度的變化而變化。乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)酶活性達(dá)到最高值，隨著乙醇濃度的增加，酶活性也開(kāi)始降低，但不明顯，這表明該OTC 酶在含酒精的發(fā)酵食品或飲料中具有一定的應(yīng)用潛力。而在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%～5%時(shí)，酶活性隨NaCl 濃度的增加而增加，在鹽NaCl 5%時(shí)酶活性最高。隨后在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～20%時(shí)，酶活性隨NaCl 濃度的增加而降低，NaCl 20%左右時(shí)酶活性最低。試驗(yàn)結(jié)果表明，即使在高鹽濃度的反應(yīng)體系中，OTC 酶活性受到的影響也不大，表明該酶在高濃度鹽的溶液中具有一定的應(yīng)用潛力。

圖6 鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶對(duì)乙醇和氯化鈉的耐受性Fig.6 Effects of ethanol and NaCl on OTCase activity

2.7 重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以精氨酸為底物，利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法測(cè)定重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的米氏常數(shù)。重組酶的Km為1.58 mmol，Vmax為5.88 mmol/min。

3 結(jié)論

以短乳桿菌的基因序列為模板，通過(guò)分子克隆手段獲得鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因，以大腸桿菌為宿主進(jìn)行重組表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA 親和層析柱純化獲得重組蛋白，研究其酶學(xué)性質(zhì)。重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶最適溫度為55°C，4 ℃下熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)異，37 ℃下放置3 h 仍保持50%以上的生物活性。然而，在65 ℃放置40 min 后已檢測(cè)不到酶活性。該酶的最適pH 值為6.5，在pH 值為堿性時(shí)，酶活力下降明顯；5% NaCl 和5%乙醇時(shí)具有最高酶活性，而整體差異不明顯，說(shuō)明重組鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶具有良好的耐鹽和酒精耐受力。動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax分別為1.58 mmol 和 5.88 mmol/min。由此可見(jiàn)，來(lái)源于短乳桿菌的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶具有良好的溫度穩(wěn)定性及耐鹽、耐酒精能力，在酒類(lèi)發(fā)酵中應(yīng)用前景看好。