王 瀟 歐雅文 李媛媛 胡小松 廖小軍 張 燕

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083）

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和膳食結(jié)構(gòu)的改變，過多的能量攝入使機(jī)體能量平衡遭到破壞，引發(fā)肥胖、胰島素抵抗等問題[1]。為了優(yōu)化膳食結(jié)構(gòu)，避免高熱量飲食帶來的負(fù)面效應(yīng)，國(guó)內(nèi)外的膳食指南中都建議飲食多元化，將“深色蔬菜攝入”提到重要的位置，增加果蔬的多樣性[2-3]。葉綠素作為自然界中最重要的光合色素，廣泛存在于各種綠色蔬菜中，在減輕炎癥，調(diào)節(jié)腸道功能方面具有保護(hù)作用[3-4]。在研究花色苷、多酚等物質(zhì)的生物活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)其能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成顯著緩解高脂飲食下的體重增加，并且隨著腸道菌群研究的興起，非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分的生物活性也逐漸被重視起來[5]。葉綠素作為綠色蔬菜中最普遍存在的非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其生物活性仍停留于早期探索，對(duì)其理解十分有限[6]。

成人每天蔬菜的攝入量應(yīng)達(dá)到300～500 g，其中1/3 或1/2 應(yīng)為綠色或深綠色蔬菜。伴隨著綠色蔬菜的攝入，其進(jìn)入人體的量是可觀的。究竟葉綠素進(jìn)入人體以后會(huì)被人體怎樣代謝，不得而知。Roca 等[7]培養(yǎng)小腸Caco-2 細(xì)胞，證明親脂性葉綠素銅鈉鹽 （SCC） 衍生物能被小腸細(xì)胞吸收5%～10%，產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)吸收水平與類胡蘿卜素相當(dāng)，水溶性SCC 衍生物能被吸收45%～60%。雖然吸收量較高，但是在小腸Caco-2 細(xì)胞中保留時(shí)間較短。Fernández 等[8]將菠菜添加到商業(yè)級(jí)狗糧中喂養(yǎng)10 d，通過檢測(cè)小狗外周血液中葉綠素衍生物水平，證明葉綠素衍生物被吸收的顯著范圍是2.5%～4.0%，平均3.4%，且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葉綠素衍生物在動(dòng)物體內(nèi)具有低吸收，快速代謝等特點(diǎn)。目前有關(guān)葉綠素在體內(nèi)代謝位點(diǎn)的研究較少。

基于此，本試驗(yàn)從葉綠素進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的代謝入手，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定葉綠素及其衍生物在大鼠各消化器官的代謝情況，對(duì)大鼠血液、尿液及糞便中的葉綠素及其衍生物進(jìn)行定量分析，同時(shí)采用16S rDNA 技術(shù)分析大鼠腸道微生物組成以及菌群多樣性，并對(duì)菌群代謝的短鏈脂肪酸進(jìn)行定量分析，探討葉綠素在大鼠體內(nèi)的生物活性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

菠菜（Spinach），購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)東校區(qū)家屬院果蔬市場(chǎng)。

SPF 級(jí)SD 大鼠，8 周齡，雌、雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物經(jīng)3 d 適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲水飲食，室溫（22±1）℃，濕度（40±10）%，光照周期12 h/12 h。

1.2 主要試劑

甲醇、三氯甲烷、正己烷、乙腈，均為色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；葉綠素a、b、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、草酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸等標(biāo)品，美國(guó)Sigma 公司；95%乙醇、濃硫酸等為分析純級(jí)，北京化學(xué)試劑公司。

1.3 儀器與設(shè)備

紫外-可見光分光光度計(jì)（UV-1800），日本島津公司；電子分析天平（BT 124S），SARTORIUS 科學(xué)儀器有限公司；液相色譜儀（UPLC，Acquity UPLC），美國(guó)Agilent 公司；高速冷凍離心機(jī)（CR21GIII），日本HITACHI 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（T6新世紀(jì)），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葉綠素的制備 葉綠素提取以及濃度測(cè)定參考李媛媛[4]、Rivera-Chávez 等[9]方法。本試驗(yàn)所得目標(biāo)樣品質(zhì)量濃度為7 mg/mL。

1.4.2 葉綠素體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn) 大鼠被灌胃濃縮葉綠素液以1 mL/100 g 計(jì)（雌鼠約250 g/只，雄鼠約300 g/只），以灌胃后時(shí)間點(diǎn)為0 點(diǎn)，24 h 內(nèi)在不同時(shí)間點(diǎn)（0，0.75，1，2，5，6，8，10，12，16，20，24 h）處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3 只大鼠進(jìn)行取樣（包括胃腸道內(nèi)容物、血液、尿液及糞便）。以不灌胃葉綠素的3 只大鼠作為空白對(duì)照。共選用20 只雌鼠，19 只雄鼠。

胃腸道內(nèi)容物用甲醇按1 g/3 mL 比例震蕩潤(rùn)洗2 min，取潤(rùn)洗液，直接冷凍保存。

取0.25 mL 血液，加0.75 mL 甲醇震蕩，以6 000 r/min，4 ℃條件下離心4 min，將離心后的上清液冷凍保存。

取尿液樣本1 mL 加入甲醇3 mL，震蕩混勻后作為檢測(cè)樣本待測(cè)。

糞便樣本（檢測(cè)葉綠素）處理：取1 g 大鼠糞便研磨成粉狀，倒入10 mL 離心管中，加入3 mL 甲醇，于振蕩器上震蕩混勻后靜置，待分層后取上清液作為檢測(cè)樣本。

糞便樣本（檢測(cè)SCFA）處理：取1 g 大鼠糞便研磨成粉狀，倒入10 mL 離心管中，加入10 mL 流動(dòng)相（稀硫酸），于振蕩器上震蕩混勻，以15 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取離心后的上清液作為檢測(cè)樣本。

1.4.3 葉綠素及其衍生物的測(cè)定 參考Teng 等[10]的方法，利用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定葉綠素及其衍生物的變化趨勢(shì)。具體方法如下：分別配制葉綠素a、b 標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度梯度，用0.22 μm 水相濾膜過濾，濾液用HPLC 測(cè)定。定量分析后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于后續(xù)葉綠素及其衍生物含量的計(jì)算。HPLC 條件為：低壓梯度HPLC 泵，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙腈作為流動(dòng)相A，體積分?jǐn)?shù)12.5%的甲醇作為流動(dòng)相B，體積分?jǐn)?shù)6% 的三氯甲烷作為流動(dòng)相C，體積分?jǐn)?shù)6.5%的正己烷作為流動(dòng)相D。柱溫30 ℃，流速1 mL/min。通過與已有葉綠素a、b標(biāo)品的出峰時(shí)間進(jìn)行比較確定衍生物。波長(zhǎng)范圍430～660 nm。

1.4.4 短鏈脂肪酸的測(cè)定 采用HPLC 測(cè)定有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等乳酸菌代謝產(chǎn)物的變化趨勢(shì)[11]。具體操作參考李媛媛等[4]方法。

1.4.5 腸道菌群豐度及多樣性的測(cè)定 大鼠被灌胃葉綠素后24 h 內(nèi)，分別取10，16 h 和24 h 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集糞便，以不灌胃葉綠素的大鼠作為空白對(duì)照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選用3 只大鼠，共18 只大鼠。

用DNA 提取試劑盒（美國(guó)MoBio 公司）提取樣本DNA，Onedrop 和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和濃度。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至0.5 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，選用DNA 聚合酶（美國(guó)Promega 公司）擴(kuò)增16S V3-V4 高變區(qū)，設(shè)計(jì)引物515 F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′ 和 806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[4]。產(chǎn)物c 純化回收后使用Pico Green 熒光定量以及Agilent 2200 TapeStation 電泳工作平臺(tái)檢測(cè)，純化后的擴(kuò)增片段在Illumina MiSeqTM 平臺(tái)上機(jī)測(cè)序并構(gòu)建文庫(kù)，電泳檢測(cè)文庫(kù)片段大小為454 bp。利用RDP classifier 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（比對(duì)閾值為70%）。應(yīng)用Mothur 進(jìn)行Operational Taxonomic Units（OTUs）劃分，以序列相似性97%為依據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

用SPSS Statistics 17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，應(yīng)用方差分析Oneway ANOVA（One-way Analysis of Varance）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，顯著水平P<0.05 時(shí)，差異顯著；P＞0.05 時(shí)，差異不顯著。采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉綠素及其衍生物在大鼠消化器官的代謝

表1列出葉綠素在大鼠不同器官的代謝情況。給大鼠灌胃葉綠素后，記錄時(shí)間為0 h。葉綠素在胃部停留約1 h 后進(jìn)入小腸，約6 h 后由小腸進(jìn)入大腸，在大腸停留約10 h 后開始從糞便排出。給大鼠灌胃葉綠素后，在胃部酸性條件下，葉綠素a 部分脫鎂形成脫鎂葉綠素a，且脫植基葉綠素伴隨形成，而葉綠素b 相對(duì)穩(wěn)定。由胃進(jìn)入小腸以及小腸進(jìn)入大腸過程中，在內(nèi)容物中檢測(cè)到葉綠素a、脫鎂葉綠素a、葉綠素b，而脫植基葉綠素消失。在糞便中也檢測(cè)到被排出的葉綠素衍生物，在血液、尿液中沒有檢測(cè)到葉綠素衍生物。在大鼠消化吸收過程中，葉綠素均無新物質(zhì)產(chǎn)生，而以葉綠素衍生物形式存在。

采用HPLC 定量分析各消化部位內(nèi)容物中的葉綠素及其衍生物，葉綠素在胃部幾乎不吸收，84%進(jìn)入大腸，其中葉綠素在糞便中的排出量約43%。由此可見，約41%的葉綠素在大腸被代謝。進(jìn)入大腸的葉綠素是否影響大腸腸道菌群變化，下面對(duì)大鼠腸道菌群進(jìn)行分析。

表1 葉綠素及其衍生物在不同消化部位的檢測(cè)量（μg/g）Table 1 Detection of chlorophyll and its derivatives in different digestion sites （μg/g）

2.2 葉綠素對(duì)大鼠腸道菌群的影響

2.2.1 大鼠糞便樣本菌群構(gòu)成及其豐度 采用16S rDNA 分析大鼠腸道菌群，由于V4 可變區(qū)較具代表性，因此分析該區(qū)菌群。由表1可知，各樣本測(cè)序深度指數(shù)（覆蓋率）達(dá)99.3%～99.5%，表明測(cè)序結(jié)果代表樣本的真實(shí)情況。ACE 和Chao 1 為樣本豐富度指數(shù)，反映預(yù)估計(jì)的OUTs 數(shù)；Shannon wiener 和Simpson 為樣本多樣性指數(shù)，反映菌群的復(fù)雜程度。根據(jù)Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，Shannon wiener 反映灌胃葉綠素的大鼠菌群多樣性顯著降低（P<0.05）。葉綠素影響腸道菌群多樣性降低，其后果好壞目前尚不知曉，需進(jìn)一步研究。

2.2.2 群落組成 如圖1所示，對(duì)測(cè)序樣品的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明：大鼠腸道微生物在門分類水平上主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）組成。

在屬水平上，大鼠腸道中豐度較高的菌屬主要為變形菌門中的埃希氏-志賀菌屬（Escherichia_shigella）、普雷沃菌屬 （Prevotella）、小類桿菌（Dialister）、腸球菌屬（Enterococcus）、腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriaceae），擬桿菌門中的擬桿菌屬（Bacteroides）、放線菌門中的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、柯林斯菌（Collinsella）。

表2 菌群測(cè)序深度及多樣性Table 2 Sequencing depth and diversity of gut microbiota

圖1 大鼠腸道菌群在門和屬水平上的豐度Fig.1 Percent of community abundance on phylum and genus level of gut microbiota in rats

2.2.3 葉綠素對(duì)大鼠腸道變形菌門水平的影響據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，變形菌門為革蘭氏陰性菌門，其中80%以上都是致病菌，會(huì)產(chǎn)生較多內(nèi)毒素，內(nèi)毒素水平升高造成小腸黏膜上皮細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)，促進(jìn)內(nèi)毒素進(jìn)入血液，引起內(nèi)毒素血癥及炎癥[12]，進(jìn)一步促進(jìn)肥胖的發(fā)生。如圖2所示，給大鼠灌胃葉綠素24 h 后，大鼠腸道菌群中變形菌門相對(duì)豐度顯著下降（P<0.05），由58%降至17%。推測(cè)葉綠素通過降低變形菌門相對(duì)豐度來降低內(nèi)毒素水平，這需要進(jìn)一步研究證明。另外，葉綠素顯著降低變形菌門相對(duì)豐度的機(jī)制尚不清楚。

圖2 大鼠腸道中變形菌門相對(duì)豐度Fig.2 The relative abundance of Proteobacteria in the rat’s gut

2.2.4 葉綠素對(duì)大鼠腸道菌群屬水平的影響 圖3a 為灌胃葉綠素24 h 后大鼠腸道菌群中阿克曼氏菌屬（Akkermansia，簡(jiǎn)稱Akk 菌）豐度的變化。疣微菌門中的Akk 菌屬是一類寄居在小腸黏液層具有黏蛋白降解功能的革蘭氏陰性菌。在人體腸道中數(shù)量雖很少，但與人體的健康密切相關(guān)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Akk 菌屬水平在肥胖和2 型糖尿病人中比健康人要低，且Akk 菌屬直接影響肥胖的發(fā)生，將從正常鼠腸道中分離到的Akk 菌屬移植到肥胖小鼠腸道中，降低了肥胖小鼠的體重[13]。研究人員還觀察到，給肥胖小鼠服用益生元（oligofructose prebiotics），能提高Akk 菌屬的相對(duì)豐度，促進(jìn)消化道屏障以及肥胖相關(guān)代謝疾病的改善，這些有益作用包括減少脂肪質(zhì)量增加、脂肪組織炎癥以及改善胰島素耐受[14]。相比于對(duì)照組，葉綠素顯著提高了疣微菌門中Akk 菌屬的豐度（P<0.05），由少于2%提高到13%。有研究用多酚復(fù)合物喂食高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠，發(fā)現(xiàn)多酚復(fù)合物顯著提高肥胖小鼠腸道菌屬中Akk 菌屬的豐度[15]，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。這表明葉綠素可以提高Akk 菌屬的水平，從而與炎癥、肥胖發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其相互的作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

乳酸菌屬（Lactobaillus）是生物體腸道中的一類“有益菌”，通過產(chǎn)生乳酸維持腸道較低的pH值，殺死不耐酸的有害菌；同時(shí)乳酸的升高，還能降解生物體內(nèi)的草酸水平，并能促進(jìn)三羧酸循環(huán)，促進(jìn)糖酵解過程，影響能量代謝[16]。一般乳酸菌屬很難在宿主體內(nèi)定植，因此水平較低。日常生活中通過攝入體外乳酸菌制品來提高體內(nèi)乳酸菌屬的數(shù)量，促進(jìn)人體健康。如圖3b 所示，給大鼠灌胃葉綠素24 h 后，其腸道中乳酸菌屬豐度顯著上升（P<0.05），由1.2%升至4%，表明葉綠素顯著影響乳酸菌屬豐度，這可能是葉綠素對(duì)宿主產(chǎn)生健康作用的一種方式，間接促進(jìn)宿主的健康發(fā)展。

雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）具有多種益生功能，可緩解乳糖不耐癥狀，改善因免疫系統(tǒng)紊亂而導(dǎo)致的腸炎，通過菌膜屏障分泌抗菌肽抑制病原菌入侵腸道等[17]。本試驗(yàn)結(jié)果如圖3c 所示，大鼠在灌胃葉綠素24 h 后，雙歧菌屬豐度顯著下降，由3.7%降至1.8%，說明葉綠素促進(jìn)雙歧菌屬豐度的下降，具體原因尚不清楚。

2.3 葉綠素對(duì)大鼠腸道菌群代謝物的影響

灌胃葉綠素24 h 后，大鼠糞便中乙酸、丙酸水平的變化如圖4所示。由圖4a 可知，灌胃葉綠素24 h 后的大鼠菌群產(chǎn)生乙酸水平顯著升高（P<0.05），在24 h 達(dá)到最大值0.25 μg/mL。圖4b 所示，丙酸水平在5～10 h 內(nèi)緩慢下降，15 h 后保持上升的趨勢(shì)，并在24 h 時(shí)達(dá)到最大值1.8 μg/mL。SCFA 為腸道菌群的代謝產(chǎn)物，不同的SCFA 具有不同的生理活性作用，如乙酸、丁酸的抗菌、抗癌作用，丙酸為糖異生的底物，且能為腸上皮細(xì)胞提供能量[18]。大鼠攝入葉綠素后，糞便中乙酸、丙酸含量升高，可能是由產(chǎn)這兩種短鏈脂肪酸的腸道微生物引起的[4]，如乳酸菌屬。本試驗(yàn)中對(duì)大鼠菌群測(cè)序，乳酸菌屬豐度有所上升。從側(cè)面說明葉綠素可能通過影響菌群或其代謝產(chǎn)物來促進(jìn)宿主的健康發(fā)展。

圖3 大鼠腸道中Akk 菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of Akkermansia，Lactobaillus and Bifidobacterium in the rat’s gut

三羧酸循環(huán)（TCA）作為生物體內(nèi)非常重要的代謝途徑之一，是三大營(yíng)養(yǎng)素（糖類、脂肪和氨基酸） 的最終分解代謝通路。檸檬酸作為有機(jī)酸之一，在人體中主要參與TCA 循環(huán)，研究發(fā)現(xiàn)在酵母培養(yǎng)中添加檸檬酸，對(duì)琥珀酸、蘋果酸和酒石酸的代謝均能產(chǎn)生一定的影響[19]。圖4c 所示為大鼠糞便24 h 時(shí)檸檬酸水平的變化，可以看出葉綠素能顯著提高大鼠糞便中檸檬酸水平 （P<0.05），且在15 h 后表現(xiàn)出顯著性差異。檸檬酸水平升高，可能是葉綠素進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，提高了糖、脂肪或氨基酸的代謝，促進(jìn)TCA 循環(huán)，使得作為TCA 循環(huán)的中間產(chǎn)物——檸檬酸水平提高，同時(shí)說明葉綠素能有效提高生物體的代謝。

圖4 乙酸、丙酸、檸檬酸水平變化（大鼠）Fig.4 Changes of acetic acid，propionic acid and citric acid in rats

3 結(jié)論

通過給大鼠灌胃葉綠素，探究葉綠素在大鼠體內(nèi)的生物代謝及對(duì)腸道菌群的影響，以此來闡明葉綠素實(shí)現(xiàn)生物活性的可能機(jī)制。葉綠素進(jìn)入胃后，在酸性條件下，部分葉綠素a 會(huì)立刻降解為脫鎂葉綠素a，葉綠素b 則較穩(wěn)定，并有少量脫植基葉綠素生成。葉綠素在大鼠胃部幾乎沒有吸收，進(jìn)入大腸的量約84%，其中從糞便中排出量約為43%，而在血液、尿液中檢測(cè)不到葉綠素含量。葉綠素在門水平上顯著降低變形菌門相對(duì)豐度（P<0.05），在屬水平上促進(jìn)阿克曼氏菌屬、乳酸菌屬豐度上升（P<0.05），雙歧菌屬豐度下降（P<0.05）。檢測(cè)菌群代謝物中，葉綠素能夠提高腸道菌群代謝物乙酸、丙酸及檸檬酸水平。