王向陽(yáng) 從俊峰 顧 雙

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310000）

高血壓作為影響心血管病的主要因素，往往是人們長(zhǎng)期飲食高能量的食物以及缺乏運(yùn)動(dòng)造成的。因長(zhǎng)期患有高血壓會(huì)使得血管、心臟、肺和腎臟等功能性器官發(fā)生病變，進(jìn)而引發(fā)腦卒中、冠心病等多種并發(fā)癥而廣泛引起人們的注意。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）作為人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中對(duì)血壓有調(diào)節(jié)作用的一種關(guān)鍵酶，通過(guò)抑制ACE 的酶活性，不僅能夠減少體內(nèi)具有強(qiáng)烈收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的生成量，還能夠減少激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）中具有血管舒張作用的緩激肽（BK）被降解量[1]。尋找有效的ACE 抑制劑引起人們極大的興趣。果蔬作為日常食物，食用量大，其可能影響ACE 活性。

目前，關(guān)于ACE 抑制劑的報(bào)道大多是以動(dòng)、植物蛋白為原料，通過(guò)不同的方法獲得具有ACE抑制活性的多肽，ACE 抑制肽的制備方法主要有水解法（包括酸、堿水解法和酶的水解法）、微生物發(fā)酵法、人工合成法（包括化學(xué)合成法和DNA 重組法）等[2]。

食源性ACE 抑制肽具有安全有效、無(wú)副作用、吸收效果好等特點(diǎn)，可將其應(yīng)用于功能性食品或者膳食補(bǔ)充劑來(lái)預(yù)防和緩解高血壓。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用麥胚、大豆、核桃、花生、莧菜白蛋白、豌豆、紅松仁清蛋白等多種原料制備出ACE抑制肽[3-5]。如吳繼紅等[6]在白酒中發(fā)現(xiàn)一種氨基酸序列為Pro-His-Pro 的多肽，具有明顯抑制ACE活性的作用。徐懷德等[7]利用木瓜蛋白酶水解核桃蛋白并分離純化獲得的多肽具有較高的ACE 抑制活性，最高達(dá)93.56%。

海洋生物也是研究ACE 抑制肽的熱點(diǎn)，沙丁魚、毛蝦、海蜇、鯰魚、黑魚等均是良好的ACE 抑制肽的蛋白源[8]。Ichimuraa 等[9]從發(fā)酵的魚醬中分離得到具有很強(qiáng)ACE 抑制活性的二肽，結(jié)構(gòu)為Ala-Pro 的二肽，IC50為29 μmol/L。苑園園等[10]發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶酶解牡蠣得到的多肽抑制ACE 效果最好。He 等[11]對(duì)三肽的QSAR 模型研究表明：當(dāng)N-端為疏水性氨基酸，中間氨基酸為帶正電荷的氨基酸Lys 或Arg 等，C-末端為體積和疏水性都較大的芳香族氨基酸時(shí)，三肽具有最高的ACE 抑制活性。胃蛋白酶對(duì)含有芳香族和脂肪族氨基酸的多肽具有很強(qiáng)的酶切特異性，而且優(yōu)先切割C-產(chǎn)生Phe 和Leu，此類多肽往往具有ACE 抑制作用[12]。

此外，也有報(bào)道非多肽物質(zhì)具有ACE 抑制效果，黃酮類及其它多酚類物質(zhì)作為食品添加劑往往也具有ACE 抑制活性[13-15]。王藝璇等[16]發(fā)現(xiàn)蘋果多酚類物質(zhì)中黃烷醇類對(duì)ACE 有較高抑制活性。Huey-Mei Shaw 等[17]報(bào)道丁香羅勒的水提取物不僅在體外具有ACE 抑制活性，對(duì)體內(nèi)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）也具有降壓效果。Brasil 等[18]用甲醇提取番木瓜中的物質(zhì)，經(jīng)LC-MS/MS 鑒定為黃酮類物質(zhì)，該黃酮類物質(zhì)在體內(nèi)具有降血壓效果。Ronchi 等[19]用乙醇提取芒果葉，葉中的阿魏酸、沒(méi)食子酸等對(duì)體外ACE 具有抑制活性，在體內(nèi)也具有降壓效果，提取液對(duì)ACE 的抑制率最高達(dá)（90±8）%。王藝璇等[16]研究不同成熟度的蘋果內(nèi)多酚物質(zhì)對(duì)ACE 酶活性的抑制情況，未成熟的蘋果多酚物質(zhì)對(duì)ACE 的抑制效果最好。Lucas 等[20]研究葡萄酒、茶、巧克力等物質(zhì)對(duì)ACE 活性的抑制效果，原花青素低聚體具有顯著的酶抑制活性，黃烷醇物質(zhì)的含量和其對(duì)ACE 活性的抑制能力呈正相關(guān)。

ACE 抑制劑是在體外對(duì)ACE 酶活性具有抑制作用的一類物質(zhì)，由于其被人體消化吸收時(shí)會(huì)被各種消化酶水解，原本具有ACE 抑制活性的物質(zhì)可能完全失活或部分活性被抑制，相反，無(wú)活性的物質(zhì)可能經(jīng)消化道和胃液作用后產(chǎn)生的新物質(zhì)具有很高的ACE 抑制活性，因此體外具有ACE抑制活性的物質(zhì)口服后不能確定一定具有降壓作用[21]。若要ACE 抑制劑在體內(nèi)發(fā)揮降壓作用，還需要進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

本試驗(yàn)前期對(duì)果蔬ACE 酶的抑制效果進(jìn)行了篩選，最終選取西蘭花、大蒜、菠菜、平菇和獼猴桃等5 種果蔬為原料，通過(guò)水提、醇提以及胃蛋白酶酶解處理的方式獲得不同提取物，測(cè)定ACE 抑制率。對(duì)提取物進(jìn)行復(fù)配，以期獲得ACE 抑制效果的增效作用，并做體內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)，旨在為開發(fā)和利用常見(jiàn)食物在高血壓病防治上的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

蔬菜（西蘭花、大蒜、菠菜）和水果（平菇和獼猴桃），購(gòu)于杭州下沙的鑫永濤生活超市。

四硼酸鈉、硼酸、無(wú)水乙醇，分析純，成都市科龍?jiān)噭┗瘜W(xué)廠；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）、馬尿酸（HA）標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)SIGMA 公司；甲醇、三氟乙酸，色譜純，美國(guó)J.T.Baker 公司；ACE 酶，實(shí)驗(yàn)室自備，從豬肺中提取，酶比活力為119.2 U/g。

1.2 主要儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV-2600），日本Shimadzu公司；高效液相色譜儀（LC-20AT），日本Shimadzu公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-210），瑞士BUCHI 公司；高速冷凍離心機(jī)（2-16KL），美國(guó)SIGMA 公司；冷凍干燥機(jī)（A65312906），美國(guó)LABCONCO 公司；臺(tái)式均質(zhì)機(jī)（D18TS25），艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蔬菜和水果提取物的制備 取30 g 蔬菜和水果以1∶3（質(zhì)量比）的比例和蒸餾水進(jìn)行勻漿處理，勻漿2 min。取勻漿液30 mL，冷凍干燥。各取凍干粉50 mg，均配制為25 mg/mL 的溶液。（1）水提：加2 mL 水，80 ℃加熱10 min，15 ℃，6 000 r/min 離心20 min，取上清提取液于-80℃冷凍。（2）酶解：加2 mL 水，再加1 mol/L HCl 溶液100 μL，調(diào)節(jié)溶液pH 值在2～3 之間，加10 μL 50 mg/mL胃蛋白酶，37 ℃反應(yīng)2 h，100 ℃加熱15 min，加1 mol/L NaOH 溶液100 μL，冷卻后，80 ℃加熱10 min，15 ℃，6 000 r/min 離心20 min，取上清提取液于-80 ℃冷凍。（3）醇提：加2 mL 無(wú)水乙醇，80 ℃加熱10 min，15 ℃，6 000 r/min 離心20 min，取上清液減壓濃縮至干，加入同體積10%乙醇復(fù)溶。將提取液-80 ℃冷凍。3 種提取物，終體積定容為2 mL。

1.3.2 醇沉物酶解提取物和上清液制備 取5 g蔬菜和水果，以1∶5（m/V）的比例與水均質(zhì)，4 ℃10 000 r/min 離心20 min，取上清液5 mL，加5mL無(wú)水乙醇，4 ℃下靜置過(guò)夜，同等條件下離心，分離上清與沉淀。（1）取上清液5 mL，減壓濃縮至干，加入5 mL 超純水溶解。（2）取沉淀，加5 mL 水，取少量溶液測(cè)定蛋白濃度。另取500 μL 蛋白溶液加10 μL 1 mol/L HCl 調(diào)pH 值至酸性，搖均后加10 μL 50 mg/mL 胃蛋白酶溶液，37 ℃下反應(yīng)2 h，沸水煮沸15 min，最后加10 μL 1 mol/L NaOH 中和HCl。

1.3.3 復(fù)配 將不同新鮮原料醇沉和非沉淀部分復(fù)配，復(fù)配方法見(jiàn)表1?！?”代表參與復(fù)配，“0”代表不參與復(fù)配，提取液各100 μL，混均，對(duì)照為超純水。復(fù)配組中（除組2 外）各樣品的劑量為原來(lái)的1/3，組2 的劑量為原來(lái)的1/2，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 不同組間的復(fù)配Table 1 Combination between different groups

1.3.4 體外模擬消化試驗(yàn) 胃蛋白酶-胰蛋白酶消化水解實(shí)驗(yàn)參考Garrett D A 等[21]。蔬菜水提物醇沉蛋白用50 mL 水溶解，用100 μL 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至1.5，加入胃蛋白酶（E/S 1∶100，m/m），在37 ℃下攪拌反應(yīng)2 h，沸水浴10 min，緩慢加100 μL 1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8，然后加入胰蛋白酶（E/S 1∶50，m/m），在37 ℃下攪拌反應(yīng)3 h，沸水浴煮沸10 min 滅酶，冷卻后2 000 r/min 離心10 min，取上清液。

1.4 試驗(yàn)測(cè)定

1.4.1 含水量 新鮮樣品稱重，置100 ℃烘箱中烘至恒重，稱重，計(jì)算含水量。

1.4.2 蛋白質(zhì)[22]吸取1.0 mL 樣品提取液，稀釋10 倍，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液混均，避光靜置2 min，測(cè)定其在595 nm 處的吸光值，重復(fù)3 次。

1.4.3 ACE 酶活性抑制效果[23]取50 μL pH8.3的0.1 mol/L 硼酸緩沖液與不同提取液50 μL 混合（相當(dāng)于1.25 mg 原料干物質(zhì)），加入160 μL 置于37 ℃下加熱10 min 的2 mg/mL ACE 酶液和40 μL 5 mmoL/L HHL 溶液，于37 ℃下反應(yīng)15 min。加入150 μL 1 mol/L HCl 終止反應(yīng)。用0.45 μm濾膜過(guò)濾，HPLC 方法測(cè)定馬尿酸的含量。水提取液的對(duì)照為超純水50 μL，乙醇提取液的對(duì)照為10%乙醇50 μL，酶解提取液的對(duì)照為0.25 mg/mL胃蛋白酶液沸水浴的50 μL 溶液，分別加入反應(yīng)體系中。

色譜條件：Hypersil ODS2 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 um）；流動(dòng)相：甲醇-超純水體積比為15∶85，超純水中含有0.1%的三氟乙酸（TFA）；柱溫箱溫度：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm。3 次重復(fù)試驗(yàn)。

取質(zhì)量濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/μL 的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液，通過(guò)HPLC 方法測(cè)定馬尿酸的含量及其對(duì)應(yīng)的峰面積之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。曲線方程式為：y=6×107x + 109179，R2=0.9999，線性關(guān)系良好。檢測(cè)范圍：0.01～0.1 μg/μL。

ACE 酶活單位的定義：在37 ℃下，每1 min催化生成1 μmoL 馬尿酸所需的酶量（U）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD），采用Microsoft Excel 2010 處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA analysis），P<0.05 具有顯著性差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 水果和蔬菜提取物對(duì)ACE 酶的抑制

不同蔬菜和水果含水量、蛋白質(zhì)含量會(huì)有差異?；邗r重比較不同果蔬抑制ACE 能力，比較直觀；基于干重比較不同果蔬抑制ACE 能力比較科學(xué)；基于蛋白質(zhì)質(zhì)量比較抑制ACE 能力，有利于發(fā)現(xiàn)哪種蛋白質(zhì)產(chǎn)生ACE 的高效抑制肽。平菇含水量最高為94.23%，大蒜含水量最少為65.24%，其它3 種果蔬含水量88.36%～92.9%。平菇、西蘭花以鮮重為基數(shù)的蛋白質(zhì)含量較少，分別為3.83 mg/g 和4.13 mg/g，而菠菜、獼猴桃、大蒜含量較高，均在6.19 mg/g 以上。以干重為基礎(chǔ)，大蒜蛋白質(zhì)含量最低，為17.81 mg/g；菠菜的蛋白質(zhì)最高，為90.11 mg/g；平菇的蛋白質(zhì)含量不低，為66.31 mg/g。

表2 5 種果蔬的含水量及蛋白含量Table 2 Water and protein contents of 5 kinds of fruits and vegetables

表3 蔬菜和水果提取液對(duì)ACE 的抑制率Table 3 Inhibition percent rate of ACE by vegetable extract

大蒜、菠菜、西蘭花、平菇水提取物對(duì)ACE 抑制率分別為26.28%，31.88%，87.00%，85.02%。而其水提蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)ACE 抑制率分別為76.62%，99.43%，97.16%，63.09%。說(shuō)明大蒜、菠菜主要是多肽抑制ACE 活性，西蘭花和平菇主要是水溶性物質(zhì)抑制ACE 活性。由于水提物質(zhì)并沒(méi)有從蛋白酶酶解物質(zhì)中分離出，因此平菇的酶解物抑制ACE 活性低于水提取物。也因此認(rèn)為平菇多肽沒(méi)有抑制ACE 活性，反而減少了平菇水提物對(duì)ACE 的抑制。西蘭花的多肽也有較強(qiáng)的抑制ACE效果。4 種蔬菜的乙醇提取物都促進(jìn)ACE 活性，而菠菜和平菇乙醇提取物促進(jìn)作用很弱，西蘭花和大蒜乙醇提取物促進(jìn)作用稍強(qiáng)。獼猴桃水提物和蛋白酶解物抑制ACE 酶活力，抑制率分別為73.99%和75.98%。這說(shuō)明抑制物質(zhì)并非多肽，而是水溶性物質(zhì)。獼猴桃的醇提物促進(jìn)ACE 活性，提高ACE 活性24.08%。

2.2 水果和蔬菜的多肽和非多肽物質(zhì)對(duì)ACE 酶的抑制效果

獼猴桃蛋白酶解提取物促進(jìn)ACE 活性。而西蘭花、菠菜、大蒜的蛋白質(zhì)酶解提取物都抑制ACE活性。以鮮重計(jì)和蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)，西蘭花酶解提取物抑制ACE 效果最好，說(shuō)明西蘭花多肽抑制ACE能力最強(qiáng)。基于干重計(jì)，菠菜酶解提取物抑制ACE效果最強(qiáng)。平菇的蛋白酶解物抑制ACE 效果不好，因此不進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解醇沉試驗(yàn)，而是進(jìn)行平菇水提上清液對(duì)ACE 的抑制試驗(yàn)。

獼猴桃和平菇的非蛋白酶解水提物都有很強(qiáng)的抑制ACE 活性，西蘭花水提物抑制ACE 效果很弱，說(shuō)明在4 ℃過(guò)夜沉淀期間，西蘭花水提物中抑制ACE 的物質(zhì)可能降解了?；邗r重，獼猴桃抑制ACE 效果強(qiáng)于平菇，而基于干重，平菇抑制ACE 活性強(qiáng)于獼猴桃。

表4 蛋白酶解的乙醇沉淀物對(duì)ACE 的抑制作用Table 4 Inhibition of ACE by pepsin hydrolysate of ethanol precipitation protein

表5 乙醇沉淀的上清液非蛋白部分對(duì)ACE 的抑制強(qiáng)度Table 5 Inhibition intensity of ACE by non-protein fraction in ethanol precipitation supernatant

2.3 5 種水果蔬菜復(fù)配對(duì)ACE 的抑制效果

果蔬提取物抑制ACE 酶所用的果蔬劑量相當(dāng)于新鮮原料稀釋600 倍（醇沉酶解組）和1 200倍（醇沉上清液組）。用HPLC 在波長(zhǎng)228 nm 處檢測(cè)馬尿酸含量的變化，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有出現(xiàn)干擾峰，說(shuō)明各復(fù)配組沒(méi)有受到樣品成分的明顯干擾。另外，樣品經(jīng)高倍數(shù)稀釋后，對(duì)ACE 還有很高的抑制活性，說(shuō)明攝入少量果蔬可能影響ACE 酶的活性（見(jiàn)圖1）。

圖1 復(fù)配組HPLC 出峰圖Fig.1 HPLC peak map of mixing groups

表6 果蔬不同復(fù)配組對(duì)ACE 抑制百分率Table 6 Inhibition percent rate of ACE by different mixing groups

水提物組具有較高抑制ACE 活性的獼猴桃和平菇，與酶解組具有較高活性的西蘭花、大蒜和菠菜復(fù)配后抑制ACE 效果顯示：西蘭花、大蒜和菠菜3 種酶解復(fù)配后，具有最高的ACE 抑制百分率為64.61%，其次為獼猴桃水提物、平菇水提物和菠菜酶解物的復(fù)配組，對(duì)ACE 抑制百分率為59.62%，都高于3 種蔬菜各自酶解提取物的抑制效果，說(shuō)明存在增效作用。而其它復(fù)配組的抑制ACE 效果受到削弱，說(shuō)明獼猴桃和平菇的水提物與大蒜、西蘭花的酶解物混合用于抑制ACE 時(shí)，存在拮抗現(xiàn)象。

2.4 3 種蔬菜酶解產(chǎn)物體外模擬消化后對(duì)ACE的抑制效果

西蘭花、大蒜和菠菜的醇沉物質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶消化后的活力較強(qiáng)，其成分很可能是多肽。其在體內(nèi)，還要經(jīng)過(guò)胰蛋白酶的消化，如口服則有可能失活。與未經(jīng)模擬消化的單一胃蛋白酶酶解后的提取物對(duì)ACE 抑制率相比，西蘭花、大蒜和菠菜3種蔬菜的酶解物經(jīng)模擬消化，抑制ACE 活性還很高。消化試驗(yàn)抑制ACE 酶的劑量相當(dāng)于原料稀釋了6 000 倍。西蘭花保留的ACE 抑制率最高，為52.05%；大蒜次之，為45.03%；菠菜抑制率最低，為37.09%，見(jiàn)表6。3 種蔬菜經(jīng)模擬消化后物質(zhì)對(duì)ACE 的抑制強(qiáng)度顯著高于胃蛋白酶處理，見(jiàn)表3。而其濃度只有后者的1/10，說(shuō)明其它未被胃蛋白酶充分降解的多肽，經(jīng)模擬消化后進(jìn)一步降解，產(chǎn)生新的抑制ACE 的多肽。同時(shí)也說(shuō)明原有的多肽抗胰蛋白酶消化。

表7 體外模擬消化多肽對(duì)ACE 的抑制率Table 7 Inhibition percent rate of ACE by polypeptide in vitro simulated digestion

3 結(jié)論

5 種果蔬的水提物和胃蛋白酶水解物抑制ACE 活性，而乙醇提取物促進(jìn)ACE 活性。獼猴桃和平菇的水提物抑制ACE 活性，兩者的多肽對(duì)ACE 的影響小。大蒜、菠菜抑制ACE 活性的主要物質(zhì)是多肽。西蘭花的水提物和多肽都強(qiáng)烈抑制ACE 活性，然而，西蘭花水提取物抑制ACE 的物質(zhì)容易降解。西蘭花多肽抑制ACE 能力最強(qiáng)。

西蘭花、大蒜和菠菜3 種酶解物復(fù)配具有增效作用。獼猴桃和平菇水提物與菠菜酶解物復(fù)配，也存在增效作用。然而，獼猴桃和平菇的水提物與大蒜、西蘭花的酶解物之間存在拮抗現(xiàn)象。

西蘭花、大蒜和菠菜的多肽經(jīng)模擬消化后，活性有較大的下降，然而仍有較高的ACE 抑制活性。西蘭花保留的ACE 抑制率最高，大蒜次之，菠菜抑制率最低。