馬曉雨 陳先鑫 胡振瀛 朱雪梅，2* 熊 華 趙 強(qiáng)

（1 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047 2 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 3 山東科技大學(xué)泰山科技學(xué)院 山東泰安271038 4 江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 南昌330052）

我國是世界上稻米產(chǎn)量最豐富的國家，每年的產(chǎn)量可高達(dá)1 850 億kg[1]。稻米中含有80%的淀粉及約8%的蛋白質(zhì)[2]，除了作為居民膳食中最重要的組成部分滿足人們?nèi)粘５娘嬍承枨笸?，還被用作動物飼料或用于生產(chǎn)淀粉糖漿、米線、味精等低附加值的產(chǎn)品[3]。隨著生活水平的不斷提高，人們對營養(yǎng)有了更好的認(rèn)知和更高的需求，大米蛋白的優(yōu)勢也逐漸被人們認(rèn)可。由于高生物效價[4]、低致敏性[5]和高消化率[6]以及符合世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的氨基酸配比[7]等優(yōu)勢，使得大米蛋白成為公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)、營養(yǎng)的植物蛋白資源，其深度加工和利用及相關(guān)營養(yǎng)保健產(chǎn)品的開發(fā)也被食品領(lǐng)域廣泛關(guān)注。然而，大米蛋白分子間通過氫鍵和二硫鍵的相互作用使得疏水性基團(tuán)相互交聯(lián)形成難溶性的聚集體[8]，疏水性氨基酸含量遠(yuǎn)高于其它蛋白[9]，導(dǎo)致大米蛋白水溶性較差，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)，如起泡性、乳化性等，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用極為受限，相關(guān)產(chǎn)品至今仍未形成規(guī)模。應(yīng)用合理的改性技術(shù)改善大米蛋白的功能性質(zhì)，拓寬其應(yīng)用范圍，提高其應(yīng)用價值，近年來備受關(guān)注?，F(xiàn)階段，常見的蛋白改性方法有物理改性、化學(xué)改性、酶法改性、基因工程法和復(fù)合法[10]，而蛋白質(zhì)的酶法修飾作為其中一種蛋白改性技術(shù)，由于其溫和的反應(yīng)條件使得反應(yīng)易于控制，加上副產(chǎn)物較少、特異性和安全性高，可以有效改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，因此被國內(nèi)外學(xué)者廣泛報道[11-13]。然而，過度水解會造成蛋白三級結(jié)構(gòu)破壞，理化性質(zhì)穩(wěn)定性下降。目前，國內(nèi)外對大米蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)的研究主要集中于蛋白質(zhì)的提取工藝以及不同蛋白酶的水解效果方面，而低、中、高水解度對于蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及抗氧化功能的影響鮮有報道。胰蛋白酶作為一種特異性蛋白酶，可以對精氨酸和賴氨酸的羧基末端進(jìn)行高效水解[14]。本文通過對大米蛋白進(jìn)行限制性酶解處理，對酶解產(chǎn)物建立水解度與結(jié)構(gòu)、功能和體外抗氧化活性的相關(guān)性，分析其影響機(jī)制，為拓寬大米蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，開發(fā)高值附加產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白（80%，干基，300 目），陜西錦泰生物工程有限公司；5-5’-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB），Sigma 公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT），Aladdin 公司；乙二胺四乙酸，索萊寶化學(xué)試劑公司；1，1-二苯基-2-苦肼基，Aladdin 公司；1-苯胺基-8-萘磺酸鹽 （ANS），Sigma 公司；1N Folin-酚，索萊寶化學(xué)試劑公司；甘氨酸、胰蛋白酶、尿素、苯酚、氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑，均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

新世紀(jì)T6 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；JSM 6701F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀，日本電子；F-4500 熒光分光光度計，日本日立公司；L-8900 氨基酸分析儀，日本HITACH；PHS-3C 精密pH 計，上海雷磁新徑儀器有限公司；Nicolet-5700 智能型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet 公司；FD-1 真空冷凍干燥機(jī)，北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；LXJ-IIB 臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；DSC 8000 差式掃描量熱儀，美國PE 公司。

1.3 方法

1.3.1 大米蛋白水解物的制備 不同水解度大米蛋白水解物的制備參照Phoon 等[14]的方法并稍作改動。具體步驟：準(zhǔn)確稱取100 g 大米蛋白粉，按照蛋白與蒸餾水1∶15 的質(zhì)量比分散，于室溫下攪拌3 h 確保蛋白充分水化。調(diào)節(jié)蛋白水溶液pH=8，于50 ℃水浴鍋中保持15 min 后，加入一定量的胰蛋白酶（酶與底物的質(zhì)量比為1∶100）水解。在酶解過程中，不斷加入1 mol/L NaOH 溶液以維持pH 值，酶解結(jié)束后迅速移入95 ℃水浴鍋中加熱15 min 使酶失活。冷卻至室溫后，復(fù)調(diào)pH=7，離心去不溶性蛋白，上清液經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.3.2 水解度的測定 根據(jù)趙新淮等[15]的方法調(diào)整后，采用甲醛滴定法測定大米蛋白的水解度。取離心后的大米蛋白酶解液5 mL 于燒杯中，加入60 mL 的去CO2超純水，開動磁力攪拌器，不斷滴加0.1 mol/L NaOH 溶液，并用精密pH 計調(diào)節(jié)至pH=8.2，加入已中和的甲醛溶液（pH=8.2）10 mL。隨后，改用0.01 mol/L NaOH 溶液將體系pH 值滴定至9.2，記錄消耗的體積。

式中，c——標(biāo)定的NaOH 的濃度 （0.01 mol/L）；V1——樣品消耗NaOH 的體積（mL）；V2——空白液消耗NaOH 的體積（mL）；cVD——蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（mg/L）；V——用于滴定水解液的體積，5 mL；htot——每克蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，通常是一個經(jīng)驗值，大米蛋白的htot=7.40 meq/g[16]。

1.3.3 表面微觀形態(tài)觀察 樣品的表面微觀形貌采用JSM 6701F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀（Scanning Electron Microscope，以下簡稱SEM）觀察。將樣品均勻平鋪至載有導(dǎo)電膠的銅塊置物臺上，經(jīng)表面真空噴金處理后，于20 kV 工作電壓下對樣品進(jìn)行觀察[17]。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 取冷凍干燥的樣品5 mg 與200 mg 溴化鉀進(jìn)行充分研磨后壓制成片，用于FT-IR 的測定。儀器參數(shù)設(shè)置為：掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32 次，分辨率4 cm-1。譜圖采用Omnic 8.0 和Peakfit 4.12分析。去卷積后做二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)，同時采用Gaussian 法進(jìn)行曲線擬合，對FSD 圖譜進(jìn)行峰歸屬后，分析樣品的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.5 差式掃描量熱（DSC）分析 將約10 mg 樣品置鋁盤中并密封，使用差式掃描量熱儀評估其熱性質(zhì)。儀器掃描溫度為20～150 ℃，升溫速度為5 ℃/min，以空鋁盤作為參考。對每個樣品的起始溫度（T0）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Te）和焓變（△H）進(jìn)行記錄、分析。

1.3.6 內(nèi)源熒光 根據(jù)Xu 等[18]的方法，將蛋白樣品溶解在10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，配制成0.1 mg/mL 的蛋白溶液，采用日立F-4500 熒光光譜儀分析。儀器參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長300～500 nm，狹縫寬度5.0 nm。以相應(yīng)的緩沖溶液作為空白對照。

1.3.7 表面疏水性的測定 使用熒光探針1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（ANS）對樣品進(jìn)行表面疏水性的測定。將蛋白樣品溶于pH 7.2 的10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，分別得到0.0025%，0.0050%，0.01%，0.015%和0.02%的樣品稀釋液。將20 μL濃度為8 mmol/L 的ANS （10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）溶液加到4 mL 樣品稀釋液中，旋渦5 s 后避光靜置10 min，用熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度。儀器參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，狹縫寬度5.0 nm。根據(jù)系列稀釋樣品的熒光強(qiáng)度-蛋白質(zhì)濃度圖的初始斜率，計算溶液的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.8 巰基（SH）含量的測定 采用Elman 法測定蛋白樣品的暴露巰基和總巰基含量。參照Zhao等[19]的方法稍作修改，具體步驟是：將1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的樣品稀釋液加到5 mL Tris-Gly 緩沖液 （0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L 甘氨酸，0.004 mol/L EDTA，pH8.0）中，測定樣品中暴露巰基的含量。將1 mL 樣品稀釋液加到5 mL 含有8 mol/L尿素的Tris-Gly 緩沖液中，測定樣品中總巰基的含量。然后，向緩沖液中加入40 μL Ellman’s 試劑（DTNB 溶于Tris-Gly 緩沖液，4 mg/mL）。將處理好的樣品在室溫下反應(yīng)15 min，于412 nm 處測定其吸光度值。巰基含量計算公式：

式中，73.53=106/（1.36×104），其中1.36×104為Ellman’s 試劑的摩爾消光系數(shù)；A412——樣品在412 nm 處的吸光度值；C——樣品溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.9 溶解度的測定 樣品的溶解性采用Lowry法[20]測定。將1%樣品分散于去離子水中，室溫下攪拌40 min，隨后用1 mol/L NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 值，繼續(xù)攪拌30 min 后4 500 r/min 離心15 min，取上清液測定蛋白含量。以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，計算樣品的溶解度。

1.3.10 乳化性和乳化穩(wěn)定性 參考比濁法[21]測定樣品的乳化性和乳化穩(wěn)定性。將樣品分散于pH7.0 的10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，得到1%樣品溶液。取20 mL 樣品溶液加入5 mL 大豆油，以分散機(jī)轉(zhuǎn)速10 000 r/min 分散60 s。迅速在距離容器底部約0.5 cm 處取50 μL 乳狀液，加至5 mL 0.1% SDS 中，充分混合后于波長500 nm 處測定吸光度值，以SDS 溶液做空白對照。10 min 后重復(fù)操作1 次。以乳化性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）來表示樣品的乳化性。

式中，C——乳化前樣品溶液的質(zhì)量濃度（g/mL）；φ——乳狀液中油的體積分?jǐn)?shù)；A0和A10——分別為0 min 和10 min 時樣品的吸光度值。

1.3.11 DPPH 自由基清除能力的測定 將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（1，2，4，8 mg/mL，2 mL）與2 mL DPPH（0.1 mmol/L，95%乙醇）混合，室溫避光反應(yīng)30 min，立即在波長517 nm 處測定樣品的吸光度值A(chǔ)1。以去離子水替代樣品作為對照組，95%乙醇替代DPPH 溶液作為空白組，并以等體積的去離子水和95%乙醇的混合液作為空白調(diào)零[22]。樣品的DPPH 自由基清除能力按照以下公式計算：

式中，A1——樣品組吸光度值；A2——空白組吸光度值；A0——對照組吸光度值。

1.3.12 還原力的測定 將樣品溶于去離子水中，分別得到1，2，4，8 mg/mL 的溶液。取2 mL 樣品溶液依次添加2 mL pH 6.6 的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀【K3Fe（CN）6】溶液，充分混勻后于50 ℃水浴保溫20 min，加入2 mL 10%三氯乙酸 （TCA） 溶液，渦旋5 s 后4 000 r/min 離心10 min。取離心后的上清液2 mL，加入相同體積的去離子水和0.4 mL 1% FeCl3溶液，于50 ℃水浴保溫10 min，待溶液的顏色由黃變藍(lán)后，于700 nm處測定吸光度。以去離子水代替樣品作為空白對照[23]。

1.3.13 ABTS 自由基清除能力的測定 參考Bkhairia 等[24]的方法并稍作修改。取2 mL 7.4 mmol/L ABTS 溶液，與2 mL 2.6 mmol/L 過硫酸鉀混合，在室溫條件下避光反應(yīng)12 h 后用95%乙醇稀釋40～50 倍，使其在734 nm 處的吸光度值為0.7±0.02，得ABTS＋工作液。取該工作液0.8 mL，加入0.2 mL 樣品，6 min 內(nèi)測定其在734 nm 處的吸光度值A(chǔ)S。以95%乙醇替代樣品作為對照組。樣品的ABTS 自由基清除能力計算公式：

式中，A0——空白樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5 和SPSS 17.0 方差分析法（ANOVA）對試驗數(shù)據(jù)作圖和顯著性差異分析，每組試驗重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

如圖1所示，大米蛋白經(jīng)酶解后，紅外光譜中無特征性吸收峰，振動強(qiáng)度略有差異，這表明酶解導(dǎo)致分子間的化學(xué)鍵和作用力發(fā)生變化，從而改變了蛋白的空間結(jié)構(gòu)。原大米蛋白（DH0）在紅外1 400～1 054 cm-1附近有明顯的振動吸收峰，這可能與原料中極少量的糖分子的-OH 振動有關(guān)。酶解過程中可溶性游離糖經(jīng)洗脫，酶解后的水解物在此區(qū)間內(nèi)的吸收峰強(qiáng)度減弱甚至消失。

紅外光譜中1 600～1 700 cm-1是蛋白質(zhì)的酰胺I 區(qū)，通?？赏ㄟ^去卷積峰形擬合得到蛋白的二級結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果見表1。相比于天然大米蛋白（DH0），酶解物中的α-螺旋和β-折疊的含量均有所降低，而β-轉(zhuǎn)角的含量顯著增加。隨著酶解程度的增大這一變化更加明顯，說明在酶解過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，有序的β-折疊結(jié)構(gòu)被破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)楦屿`活舒展的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。同時伴隨著分子內(nèi)更強(qiáng)的氫鍵作用，這種結(jié)構(gòu)有助于蛋白分子緊密吸附于油水界面上，具備更好的乳化性能[25]。Yong 等[26]利用谷氨酰胺酶處理麥谷蛋白后麥谷蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加靈活，同時也伴隨著β-折疊含量降低，β-轉(zhuǎn)角含量增加的現(xiàn)象。

圖1 不同水解度大米蛋白的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

表1 不同水解度大米蛋白的二級結(jié)構(gòu)Table 1 Secondary structure content of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

2.2 表面微觀結(jié)構(gòu)（SEM）

圖2為大米蛋白及其酶解產(chǎn)物在掃描電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)。天然大米蛋白結(jié)構(gòu)緊密，表面較為平整光滑，呈現(xiàn)塊狀。而酶解處理后結(jié)構(gòu)變得疏松無序，分子被水解成更小的片段，且在水解度高的情況下出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，表面有細(xì)小空洞，呈顆粒狀。這表明大米蛋白經(jīng)酶解處理后結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，具有更小的分子結(jié)構(gòu)，且疏松多孔的質(zhì)地結(jié)構(gòu)更有利于在水中的溶解和分散。

圖2 不同水解度的大米蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 Surface microstructure of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

2.3 熱特性分析

不同水解度的大米蛋白的熱力學(xué)特性如表2所示。樣品在升溫的過程中，由于涉及蛋白質(zhì)間新的分子鍵的生成和分子內(nèi)的折疊與解折疊，因此出現(xiàn)變性溫度和焓的變化。當(dāng)水解度為2%和4%時，蛋白的變性溫度相比于天然大米蛋白有所提高，說明適度的水解可以提高蛋白的熱穩(wěn)定性，擴(kuò)大蛋白的應(yīng)用范圍；而當(dāng)水解度為8%時，蛋白的變性溫度降至80.30 ℃，此時的DSC 圖譜沒有明顯的吸熱峰（數(shù)據(jù)未顯示），表明過度水解會破壞蛋白內(nèi)和蛋白間維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵，加劇蛋白分子間的聚集，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的耐熱性降低。

表2 不同水解度的大米蛋白的熱力學(xué)行為Table 2 Thermodynamic behavior of rice protein hydrolysates with different degrees of hydrolysis

2.4 內(nèi)源熒光

內(nèi)源熒光強(qiáng)度在一定程度上反映色氨酸和酪氨酸殘基暴露于水中的程度，表明它們之間特殊的相互作用和蛋白質(zhì)構(gòu)型的變化，從而體現(xiàn)蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化[27]。當(dāng)更多的發(fā)色團(tuán)暴露于溶劑中時，熒光光譜的最大值發(fā)生紅移；反之，當(dāng)更多的發(fā)色團(tuán)嵌入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部時，則表現(xiàn)為藍(lán)移[28]。從圖3可以看出，經(jīng)過酶水解的大米蛋白熒光強(qiáng)度顯著增加，這一過程伴隨著紅移效應(yīng)。大米蛋白的λmax為333.2 nm，酶解后λmax隨之增大，當(dāng)DH 為8%時達(dá)到最大值349.2 nm。這表明，酶解過程使得更多的發(fā)色集團(tuán)暴露于溶劑中。其中當(dāng)DH從0 增至2%時變化最為顯著，說明胰蛋白酶的參與使得生色基團(tuán)很快暴露，隨著水解程度的增大，這一進(jìn)程逐漸減緩。

圖3 不同水解度的大米蛋白內(nèi)源熒光變化Fig.3 Intrinsic fluorescence of rice protein with different DH

2.5 表面疏水性及巰基含量分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性受蛋白質(zhì)種類和酶的特異性的影響，并隨著水解度的增大表面疏水性增加或降低。不同水解度的大米蛋白表面疏水性如圖4a 所示。與天然大米蛋白相比，經(jīng)酶解處理的樣品表面疏水性顯著降低（P＜0.05），其中水解度2%的大米蛋白酶解產(chǎn)物的表面疏水性最低。這可能是因為輕度的水解使得蛋白分子舒展，部分被水解成更小的片段，同時這些小的片段在疏水作用和二硫鍵的作用下重新聚集，使得表面疏水性基團(tuán)的數(shù)量減少，導(dǎo)致表面疏水性降低[29]。隨著酶解程度的增大，這些小的片段解折疊，抑制了二硫鍵的生成及小分子肽的聚集，使得更多的疏水基團(tuán)暴露，這也是隨著水解度的增大表面疏水性升高的原因[30]。

蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的含量決定了其剛性結(jié)構(gòu)，并對其功能性質(zhì)影響顯著。圖4b 顯示大米蛋白在酶解前、后巰基（總巰基和暴露巰基）含量的變化。與天然大米蛋白相比，酶解過程使得巰基含量降低，這可能是由于在胰蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的巰基被破壞，巰基基團(tuán)之間的空間阻礙被解除，游離巰基之間形成二硫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致巰基含量降低。也可能是在酶解過程中蛋白質(zhì)分子內(nèi)的巰基被氧化成二硫鍵，造成巰基含量降低。而蛋白結(jié)構(gòu)隨著酶解程度的增大發(fā)生解折疊，促使二硫鍵斷裂并形成新的巰基，使巰基含量升高。

圖4 不同水解度的大米蛋白表面疏水性（a）和巰基含量（b）Fig.4 Surface hydrophobicity（a） and sulfhydryl（b） of rice protein with different DH

2.6 溶解性

溶解性是決定蛋白功能性質(zhì)的先決條件，因此良好的溶解性對于蛋白質(zhì)的起泡性和乳化性至關(guān)重要。在不同pH 條件下大米蛋白在酶解前、后的溶解性如圖4所示。大米蛋白在不同的pH 條件下顯示出不同的溶解度，其中在等電點附近溶解性最差，遠(yuǎn)離等電點后溶解性逐漸增大。這是由于在等電點附近蛋白分子間的靜電斥力減小，蛋白出現(xiàn)聚集而導(dǎo)致溶解度降低[31]。與天然大米蛋白相比，經(jīng)酶解處理的樣品溶解性有了明顯的提升，這是因為天然大米蛋白具有致密的分子結(jié)構(gòu)，其亞基通過分子內(nèi)或分子間的二硫鍵和疏水相互作用進(jìn)行交聯(lián)[32]，而酶解過程促使大米蛋白分子的巰基斷裂，分子質(zhì)量降低，肽鏈?zhǔn)嬲?，暴露出更多的親水性基團(tuán)，不溶性的聚集體含量降低，從而使得溶解性增加[33]。另外，酶解過程使蛋白質(zhì)的等電點發(fā)生偏移，這可能是由于蛋白質(zhì)水解物的帶電基團(tuán)的種類和數(shù)量發(fā)生了變化，從而引起等電點的變化，這與Xu 等[18]的研究結(jié)果是一致的。

2.7 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)的兩親性常被應(yīng)用于食品乳液制備中。乳化特性是植物蛋白重要的物化特性之一，包括乳化性和乳化穩(wěn)定性。通常情況下，乳化性越強(qiáng)，形成乳狀液越穩(wěn)定，越不容易形成沉淀。圖6顯示大米蛋白在酶解前、后乳化性及乳化穩(wěn)定性的變化。經(jīng)胰蛋白酶處理的大米蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均有明顯的提高，可能與大米蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性和肽鏈靈活性增加有關(guān)，水解度在一定范圍內(nèi)對乳化性的影響沒有顯著性差異（P<0.05）。酶解后的大米蛋白斷裂成許多肽段，有更多的親水基團(tuán)暴露于水相中，大量肽分子附著于油水界面，降低了界面張力，親水基團(tuán)緊密包裹在油層表面，增加了其親水、親油平衡值，進(jìn)而提高了乳化性。而乳化穩(wěn)定性呈先升高后降低的趨勢，這表明乳化穩(wěn)定性和乳化性不一定呈正相關(guān)。這可能是由于過度的水解導(dǎo)致蛋白質(zhì)被分解成更小的肽段，使其在油水界面的相互作用受到抑制，肽段之間的電荷斥力造成乳狀液的穩(wěn)定性降低。

圖5 不同水解度大米蛋白的溶解性差異Fig.5 Solubility of rice protein with different DH

圖6 不同水解度大米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性差異Fig.6 Emulsifying activity index（EAI） and emulsifying stability index（ESI） of native and hydrolyzed rice protein

2.8 體外抗氧化活性

由于抗氧化機(jī)制的不同，因此使用多種測定方法（DPPH 自由基抑制能力、還原力和ABTS 自由基清除能力） 對大米蛋白及其酶解物的抗氧化性質(zhì)進(jìn)行評估。選取5 個質(zhì)量濃度（0，1，2，4，8 mg/mL），測定這些樣品的水解度，以常見抗氧化劑BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）作為陽性對照。

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 DPPH 自由基是一種常見的自由基，能夠在有機(jī)試劑中穩(wěn)定存在，在波長517 nm 處有明顯吸收，在清除劑存在的情況下自由基的孤對電子迅速配對，使吸光度發(fā)生變化。圖7a 比較了不同水解度的大米蛋白在不同濃度下對DPPH 自由基的抑制率，結(jié)果顯示，隨著樣品濃度的升高，其自由基抑制能力提高，即樣品的濃度與其DPPH 自由基抑制能力呈現(xiàn)正相關(guān)。在相同濃度下大米蛋白酶解物的DPPH 自由基抑制能力明顯高于天然大米蛋白，說明酶解物具有更強(qiáng)的供氫能力，通過終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將自由基轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而清除自由基[34]。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度低于2 mg/mL 時，DPPH 抑制率隨濃度的增大呈現(xiàn)較快的增長；當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度高于2 mg/mL 時，抑制率的增長速度逐漸減緩。在不同的樣品中DPPH 自由基的抑制率存在較為明顯的差異，其中水解度為2%的大米蛋白酶解物表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH 自由基抑制能力，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時抑制率達(dá)80.32%，與同濃度下BHT 的抑制率（81.05%）基本持平。還有研究表明蛋白水解物的DPPH 抑制能力與疏水性氨基酸和表面疏水性有關(guān)，通常情況下表面疏水性越低抑制能力越強(qiáng)[35]，這與作者先前的研究結(jié)果一致（圖4）。

2.8.2 還原力 還原力是評價天然產(chǎn)物提供氫和電子能力大小的一個重要指標(biāo)。大米蛋白及酶解物可作為電子供體將K3Fe（CN）6中Fe3+還原為Fe2+并產(chǎn)生普魯士藍(lán)色，樣品在700 nm 處的吸光度值即可表示還原力的大小。通常情況下，溶液的顏色越深，吸光度值越大，還原力越強(qiáng)。圖7b 顯示不同水解度的大米蛋白還原力的差異。大米蛋白及酶解物的還原力均與樣品濃度呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，酶解后的大米蛋白相較天然大米蛋白具有更強(qiáng)的還原力。這可能是由于酶解反應(yīng)提高了蛋白的溶解性，隨著酶解過程的進(jìn)行，一些具有還原性的肽段不斷被水解出來，導(dǎo)致還原力提高。在較低的樣品濃度下，水解度越高還原力越強(qiáng)，而當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時，不同水解度的大米蛋白的還原力無顯著性差異。

2.8.3 ABTS 自由基清除能力 圖7c 為不同水解度的大米蛋白對ABTS 自由基清除能力的影響。ABTS 在一些氧化劑的作用下被氧化成深綠色的ABTS·+工作液，在抗氧化化合物存在的情況下會抑制ABTS·+的生成，表現(xiàn)為在波長734 nm 處吸光度值降低。研究發(fā)現(xiàn)，酶解后的大米蛋白ABTS自由基清除率明顯高于天然大米蛋白，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度低于2 mg/mL 時，水解度為2%的大米蛋白顯示出略低的清除率；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度大于2 mg/mL 時，大米蛋白酶解物均表現(xiàn)出良好的ABTS 自由基清除能力且清除率高達(dá)95%以上，與BHT 相當(dāng)。

圖7 不同水解度大米蛋白的DPPH 自由基抑制能力（a）、還原力（b）和ABTS 自由基清除能力（c）變化Fig.7 DPPH radical scavenging activities（a），reducing power（b） and ABTS radical scavenging activities（c） of rice protein with different DH

3 結(jié)論

以大米蛋白為研究對象，制備不同水解度的大米蛋白酶解物，探究水解度對其結(jié)構(gòu)、功能以及體外抗氧化活性的影響，結(jié)果顯示：酶解過程可以改善大米蛋白的結(jié)構(gòu)功能特性，且體外抗氧化活性也顯著提高。以天然大米蛋白為對照，經(jīng)過酶解處理的大米蛋白具有更加靈活舒展的二級結(jié)構(gòu)，使其更有利于吸附在油水界面，提高乳化性能。酶解物的結(jié)構(gòu)疏松多孔，大大提高其溶解性。適度的水解可以提高大米蛋白的熱穩(wěn)定性，而水解度為8%時酶解物結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致耐熱性降低。同時，酶解過程也會引起蛋白質(zhì)發(fā)色團(tuán)、表面疏水性基團(tuán)以及巰基含量的變化。另外，對比天然大米蛋白，酶解后的產(chǎn)物在抗氧化活性方面顯著提升。大米蛋白作為一種低敏、安全且高品質(zhì)、低價格的蛋白質(zhì)，可以通過酶法改性擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，充分挖掘其潛在的商業(yè)價值，以滿足消費需求。