韋仕榮 高玉娟 韋曉陽(yáng) 蒙 真 覃 俏 黃華生

(1 廣西河池市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河池市 547000,電子郵箱：weishirong8233@163.com；2 廣西柳州市中醫(yī)醫(yī)院腦病科,柳州市 545000)

腦卒中是由于動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄或閉塞導(dǎo)致腦組織缺血缺氧的一種臨床常見腦血管疾病,分為缺血性和出血性兩大類,其中缺血性腦卒中占60%～80%；腦卒中好發(fā)于40歲以上人群,且隨著我國(guó)老齡人口增多,腦卒中發(fā)病率以每年8%的速度上升,且其病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率較高,嚴(yán)重危害患者生命健康[1-3]。目前對(duì)急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)尚無(wú)統(tǒng)一有效的治療方案,AIS治療時(shí)間窗有限,能夠通過(guò)有效的溶栓獲救的患者不足3%,因此早期診斷并及時(shí)干預(yù)對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義[4]。血清標(biāo)志物檢測(cè)廉價(jià)、快捷,逐漸成為評(píng)估神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)可參與基因表觀遺傳調(diào)控,在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。miRNA-20b可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)生成來(lái)減少血管生成[7]。另有研究報(bào)道,miRNA-199a可抑制低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)生成進(jìn)而調(diào)控VEGF表達(dá),在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用,且miRNA-199a、HIF-1α、VEGF均對(duì)AIS病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有不良影響[8-9]。但目前關(guān)于血清miRNA-20b、miRNA-199a在AIS中的作用鮮有報(bào)道。本研究探討血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與AIS患者神經(jīng)功能缺損程度及側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月至2019年11月河池市人民醫(yī)院收治的126例AIS患者為觀察組,符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[10]關(guān)于急性缺血性腦血管病的診斷標(biāo)準(zhǔn),患者首發(fā)癥狀主要有頭暈頭痛、偏癱、身體單側(cè)麻木及語(yǔ)言不清等。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均于發(fā)病后72 h內(nèi)入院；(2)均經(jīng)頭部CT或MRI檢查確診；(3)患者均為首次發(fā)病,入院前未接受過(guò)溶栓治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院時(shí)昏迷的患者；(2)既往有腦卒中病史或神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；(3)合并腦外傷者；(4)頭顱惡性腫瘤或身體其他部位惡性腫瘤出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移者；(5)患自身免疫性疾病、全身感染性疾病或血液性疾病者。其中男性70例,女性56例,年齡45～80(63.54±8.93)歲。根據(jù)腦側(cè)支循環(huán)形成情況分為一級(jí)側(cè)支循環(huán)組45例，二級(jí)側(cè)支循環(huán)組41例，三級(jí)側(cè)支循環(huán)組40例。其中，一級(jí)側(cè)支循環(huán)組男性24例,女性21例,年齡45～79(61.47±8.62)歲；二級(jí)側(cè)支循環(huán)組男性23例,女性18例,年齡45～80(62.85±8.73)歲；三級(jí)側(cè)支循環(huán)組男性23例,女性17例,年齡45～80(63.94±8.41)歲。另選取同期在河池市人民醫(yī)院行健康體檢者126例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：體檢健康者。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎疾病、自身免疫性疾病、酗酒(平均日飲酒量折合酒精≥125 g，且至少持續(xù)10年)者、冠心病或急性腦梗死者。其中男性73例,女性53例，年齡45～81(64.39±8.76)歲。觀察組和對(duì)照組的年齡、性別比較,以及觀察組中3個(gè)亞組AIS患者的年齡、性別比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)河池市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽字確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本采集：采集所有研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血5 mL,常溫下3 000 r/min離心15 min,留取血清,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清miRNA-20b、miRNA-199a相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)：參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取血清總RNA,采用紫外分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼公司，型號(hào)：DU800，檢測(cè)波長(zhǎng)為260/280 nm)檢測(cè)其濃度及純度，OD比值(OD260/280)在1.8～2.1之間表示RNA質(zhì)量合格。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，將獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(反轉(zhuǎn)錄條件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，10 min)，并置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測(cè)血清miRNA-20b、miRNA-199a水平。TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司(批號(hào)：RR0944、RA3352、RK07132)。引物由碧云天生物技術(shù)研究所合成。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,雙蒸水6 μL。qRT-PCR反應(yīng)采用兩步法,條件設(shè)置為：95℃,30 s；95℃,5 s；60℃,34 s,40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。miRNA-20b上游引物序列為：5′-TGTCAACGATACGCTACGA-3′,下游引物序列為5′-GCTCTAGTGCAGGTAGAGC-3′；miRNA-199a上游引物序列為5′-TTCACTCCCATCAGTGTCAGCT-3′,下游引物序列為5′-CGTGCTTGTACTCCAGTCTCAA-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,下游引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCt法定量分析血清miRNA-20b、miRNA-199a水平的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 血清HIF-1α、VEGF水平檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清HIF-1α、VEGF水平,試劑盒分別購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào)：PH368)、美國(guó)Invitrogen公司(批號(hào)：BMS277-2)。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 神經(jīng)缺損程度評(píng)定方法：按照我國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議通過(guò)的《腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(1995)》[11]評(píng)估AIS患者入院時(shí)中國(guó)卒中量表(China Stroke Scale,CSS)評(píng)分,內(nèi)容包括意識(shí)水平、凝視功能、言語(yǔ)、面肌、上肢肌力、手肌力、下肢肌力、步行能力等,總分最高45分,其中0分為正常，1～15分為神經(jīng)功能輕度損傷,16～30分為神經(jīng)功能中度損傷,31～45分為神經(jīng)功能重度損傷。

1.2.5 側(cè)支循環(huán)形成分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：入院后所有AIS患者均行頭部MRI+磁共振血管造影檢查。磁共振血管造影檢查發(fā)現(xiàn)，Willis環(huán)交通支開放供血，顱外動(dòng)脈系統(tǒng)通過(guò)顳淺動(dòng)脈-眼動(dòng)脈血管連接，顱內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)通過(guò)軟腦膜與腦膜中動(dòng)脈血管連接，或不同腦室間軟腦膜血管相互連接形成,即為側(cè)支循環(huán)形成。根據(jù)其開放層次分為三級(jí)：一級(jí)側(cè)支循環(huán),主要由Willis環(huán)的血管構(gòu)成；二級(jí)側(cè)支循環(huán),腦動(dòng)脈、軟腦膜及其他相對(duì)較小的側(cè)支與側(cè)支吻合支；三級(jí)側(cè)支循環(huán)：通過(guò)血管生成的方式產(chǎn)生新生血管。側(cè)支循環(huán)級(jí)數(shù)越高,提示側(cè)支循環(huán)形成越良好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組間比較用t或t′檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料以[M(Q1,Q3)]表示,多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示,兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson或Spearman法分析血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與CSS評(píng)分、HIF-1α、VEGF水平的相關(guān)性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象的血清miRNA-20b、miRNA-199a相對(duì)表達(dá)水平的比較 觀察組血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均高于對(duì)照組(均P<0.05),見表1。

表1 兩組血清miRNA-20b、miRNA-199a相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 3組AIS患者CSS評(píng)分、血清miRNA-20b、miRNA-199a、HIF-1α、VEGF水平的比較 隨著側(cè)支循環(huán)級(jí)數(shù)增加,AIS患者CSS評(píng)分、血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均降低,血清HIF-1α、VEGF水平均升高(均P<0.05)。見表2。

表2 3組AIS患者CSS評(píng)分、血清miRNA-20b、miRNA-199a、HIF-1α、VEGF水平的比較

2.3 3組AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與CSS評(píng)分、HIF-1α、VEGF水平的相關(guān)性分析 AIS患者血清miRNA-20b水平與miRNA-199a水平呈正相關(guān),且血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均分別與CSS評(píng)分呈正相關(guān),與HIF-1α、VEGF水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見表3。

表3 AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與CSS評(píng)分、HIF-1α、VEGF水平的相關(guān)性分析

3 討 論

腦側(cè)支循環(huán)是指當(dāng)大腦供血?jiǎng)用}出現(xiàn)嚴(yán)重狹窄或閉塞時(shí),血流可通過(guò)側(cè)支血管到達(dá)腦缺血部位,從而使AIS患者腦組織得到不同程度灌注代償。研究顯示,卒中后患者神經(jīng)功能缺損程度與側(cè)支循環(huán)形成有關(guān),良好的側(cè)支循環(huán)可減少腦缺血發(fā)生率且預(yù)示預(yù)后良好[12]。

Little等[13]的研究結(jié)果顯示,側(cè)支循環(huán)良好的AIS患者神經(jīng)功能缺損評(píng)分、最終梗死面積及溶栓后再灌注情況明顯好于側(cè)支循環(huán)不良者。本研究結(jié)果顯示,隨著側(cè)支循環(huán)級(jí)數(shù)增加,AIS患者的CSS評(píng)分依次降低(P<0.05),提示側(cè)支循環(huán)形成可能有利于減輕神經(jīng)缺損程度。

VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原,具有促血管生成及促血管通透效應(yīng),研究顯示,VEGF水平是冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的影響因素[14]。局部組織缺血缺氧可誘導(dǎo)細(xì)胞低氧環(huán)境應(yīng)答轉(zhuǎn)錄復(fù)合物HIF-1α表達(dá)增加,HIF-1α是VEGF上游基因產(chǎn)物,其可通過(guò)增加VEGF的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移,增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性,促進(jìn)血管生成,緩解缺血環(huán)境對(duì)機(jī)體造成的損傷[15]。近來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn),miRNA可通過(guò)作用于HIF-1α、VEGF而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16]。其中miRNA-20a在冠心病患者血漿中呈低表達(dá),其可通過(guò)調(diào)控VEGF表達(dá)參與冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成[17]。miRNA-20b屬于miRNA-17-92基因簇產(chǎn)物,與miRNA-20a具有高度同源性,其在調(diào)控血管生成中發(fā)揮重要作用[18]。劉憶華等[19]的研究顯示,miRNA-20b在肝癌組織中呈高表達(dá),可通過(guò)調(diào)控HIF-1α、VEGF表達(dá)水平促進(jìn)腫瘤血管生成以適應(yīng)低氧環(huán)境,并促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。惠素艷[20]的研究顯示,miRNA-199a定位于19號(hào)染色體,與缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān), miRNA-199a-5p在缺血性腦卒中患者血清中呈高表達(dá),且在缺血性腦卒中急性期、亞急性期和恢復(fù)期的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。茍鳳釵等[21]的研究顯示,miRNA-199a可通過(guò)靶向HIF-1α/VEGF通路,抑制缺氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的血管生成。本研究結(jié)果顯示,觀察組血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均高于對(duì)照組(均P<0.05),提示血清miRNA-20b、miRNA-199a水平升高可能與AIS的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,隨著側(cè)支循環(huán)級(jí)數(shù)增加,AIS患者的CSS評(píng)分、血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均依次降低,血清HIF-1α、VEGF水平均升高(P<0.05),且血清miRNA-20b水平與miRNA-199a水平呈正相關(guān),血清miRNA-20b水平、miRNA-199a水平均分別與CSS評(píng)分呈正相關(guān),與HIF-1α、VEGF水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05),提示血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與AIS患者神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度呈正相關(guān),兩者可能發(fā)揮協(xié)同作用,共同降低HIF-1α、VEGF的表達(dá)水平,從而減少側(cè)支循環(huán)形成。

綜上所述,AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均呈高表達(dá),兩者與AIS患者神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān),并可能通過(guò)降低HIF-1α、VEGF表達(dá)水平來(lái)減少側(cè)支循環(huán)形成。但由于本研究樣本量少,且未能進(jìn)一步分析AIS患者血清中的miRNA-20b、miRNA-199a與HIF-1α、VEGF是否存在直接靶向關(guān)系,今后仍需加大樣本量、進(jìn)一步深入探討。