劉海英，吳 晨，秦紅霖

濟生腎氣膠囊是由熟地黃、牡丹皮、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉等十位中藥，經(jīng)煎煮提取加工而成的內(nèi)服制劑，臨床常用于腎虛水腫、腰膝酸重的治療。濟生腎氣膠囊由北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院研發(fā)此制劑，但原標準中無含量測定，丹皮酚是該處方的活性成分[1-2]，為更好對該制劑進行質(zhì)量控制，本研究建立了濟生腎氣膠囊丹皮酚反相高效液相色譜(RP-HPLC)含量測定方法?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與儀器

1.1儀器設(shè)備 Agilent 1200 Series高效液相色譜儀(美國Agilent)。

1.2材料與試藥 丹皮酚對照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號：0708-9704)，濟生腎氣膠囊(北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院制劑室制備，批號：130624、131024、131123)甲醇為色譜純，水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1丹皮酚測定色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)，柱溫為30℃；流動相：甲醇-水(55∶45)；檢測波長為274 nm；流速為1.0 ml/min；進樣量為10 μl。

2.2溶液配制

2.2.1對照品溶液配制：精密稱取丹皮酚對照品適量，置棕色量瓶中，加適量甲醇制成濃度為51.5 μg/ml的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2 ml置于10 ml棕色量瓶中，作為濃度為15.45 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液配制：取裝量差異項下內(nèi)容物，混合，研磨均勻，取3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，密塞，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過即得。

2.2.3陰性對照溶液配制：按處方中藥材比例，去除牡丹皮外的其他藥材，按供試品溶液配制的工藝流程制備成不含牡丹皮的陰性對照溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μl進樣檢測。

2.3專屬性試驗 取丹皮酚對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，按2.1方法檢測，采用DAD全波長掃描，結(jié)果顯示丹皮酚出峰時間為49.273 min,陰性對照溶液未見明顯雜質(zhì)峰干擾，表明濟生腎氣膠囊組方中的其他成分在該色譜條件下對丹皮酚的含量測定未產(chǎn)生影響。理論塔板數(shù)按丹皮酚峰計>5000，丹皮酚與相鄰峰的分離度>1.5。記錄色譜圖。見圖1。

圖1 濟生腎氣膠囊的反相高效液相色譜圖

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取51.5 μg/ml丹皮酚對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml分別置10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各取10 μl，依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標作圖，得到標準曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)：Y=86.3633X(r=0.9995)。結(jié)果表明丹皮酚在2.575～25.75 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5進樣精密度考察 取濃度為51.5 μg/ml對照品溶液，按照2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，丹皮酚色譜峰面積的流速精密度(RSD)為0.29%，儀器精密度符合要求。

2.6穩(wěn)定性考察 取供試品溶液(批號130624)，按照2.1項下的色譜條件進行分析，分別于0、3、5、8、10、12 h進樣6次，結(jié)果表明丹皮酚峰面積的RSD 為0.30%，符合要求。

2.7重復性試驗 取同一批次(批號130624)濟生腎氣膠囊，按照2.2.2 項下的方法制備供試品溶液6份，并按照2.1項下的色譜條件進行測定。結(jié)果表明，丹皮酚的平均含量為0.0648 mg/g，RSD為0.95%，重復性較好。

2.8加樣回收率試驗 精密量取已知含量的濟生腎氣膠囊(批號：130624)9 份，每份1.5 g，分別精密加入對照樣品溶液相當于中丹皮酚含量的100%，每個濃度平行做3 份，按2.1項色譜條件測定，計算回收率。見表1。

表1 濟生腎氣膠囊中丹皮酚的加樣回收率試驗結(jié)果

2.9樣品含量測定 按2.2項下方法制備丹皮酚對照品溶液和濟生腎氣膠囊樣品溶液，分別取上述對照品溶液和樣品溶液各10 μl 進樣，依照2.2項下色譜條件分析，外標法以峰面積計算樣品中丹皮酚含量，共測定3批樣(130624、131024、131123)，含量為(0.0648、0.0644、0.0523)mg/g。

3 討論

丹皮酚定量的方法較多，如恒電流庫侖法、紫外分光光度法、但這些方法前處理方法復雜[3-5]。利用HPLC的高分離性能，可以使丹皮酚與其他成分有效分離，快速測定多成分中藥制劑中丹皮酚的含量[6]。HPLC是色譜技術(shù)的分支，液體作為流動相，高壓輸注系統(tǒng)將極性不同單一溶劑或不同溶劑和緩沖液的混合物的流動相泵送至固定相，在色譜柱中的組分分離后，色譜柱進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)品的分析[7-8]。用丹皮酚對照品溶液在190～600 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，結(jié)果在274 nm波長處有最大吸收峰，且干擾較小，故確定檢測波長為274 nm[9-10]。本研究曾嘗試使用不同濃度的甲醇作為溶劑，超聲、加熱回流提取丹皮酚[11-12]，結(jié)果顯示加熱回流2 h提取效果較超聲效果顯著。用甲醇作為溶劑時，峰面積和峰形效果最佳。因此確定以甲醇作為溶劑，加熱回流2 h作為提取條件。

在HPLC色譜條件研究中，對流動相進行了相關(guān)考察，參考文獻所用流動相比例為甲醇-水-冰乙酸(50∶50∶1)[13]，甲醇-水(80∶20)[14]，甲醇-水(45∶55)[1，15]，不同甲醇和水的比例對峰形、拖尾、分離度有較大影響，經(jīng)反復調(diào)整比例，最終確立甲醇-水(55∶45)為該制劑的色譜條件。另外，筆者對不同廠家柱子進行了相關(guān)考察，結(jié)果表明耐用性良好。

綜上所述，采用RP-HPLC法測定濟生腎氣膠囊中丹皮酚含量，操作方法簡單、準確、快速且重復性好、結(jié)果可靠，可以為該膠囊質(zhì)量控制和質(zhì)量評價提供參考。