樊菲菲，謝建剛，趙丹琿，王倩梅，程云會，劉傳明

膿毒癥是由感染所誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，當宿主對感染反應失調(diào)，可引起多器官功能障礙甚至危及生命。肺是膿毒癥發(fā)生時最容易也是最早被累及的靶器官之一，常表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。膿毒癥發(fā)生時，活化后的免疫調(diào)節(jié)因子高遷移率族蛋白B1(high-modility groupbox 1, HMGB1)可與Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)相互作用，通過核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)引起下游炎性因子釋放，加重全身炎癥反應。NF-κB的核移位是誘導炎癥基因表達的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在SIRS和急性肺損傷(acute lung injury, ALI)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是導致ALI的重要機制[1]。近十年來靜脈輸入高滲鹽水被用于創(chuàng)傷失血性休克的液體復蘇；既往研究證實，高滲鹽水可通過抑制細胞或大鼠模型的NF-κB-IκB通路影響促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平[2]。另有文獻報道，通過靜脈輸入高滲鹽水可通過抑制HMGB1途徑減輕嚴重燒傷大鼠的腎臟及腸道損傷[3-4]。但在高滲鹽水容量復蘇過程中，患者容易出現(xiàn)嚴重心律失常[5]，具有較高的早期病死率及整體病死率，這可能與高滲鹽水替代大于約10%的血容量時會對機體凝血功能造成影響有關(guān)[5-6]。霧化吸入高滲鹽水被用于治療囊泡性肺間質(zhì)纖維化和新生兒毛細支氣管炎，且對創(chuàng)傷性休克大鼠肺損傷有保護作用[7]。本實驗觀察了霧化吸入高滲鹽水對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用，并探討了其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選用健康成年SD大鼠30只，體重250 g左右，空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(陜)2019-001。適應性飼養(yǎng)1周，實驗前12 h大鼠禁食不禁水，同時給予腸外營養(yǎng)70 kcal/d。將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、高滲鹽霧化組，每組10只。

1.2主要儀器和試劑 超聲霧化機購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；雙光束紫外分光光度計購自上海天美科學儀器有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-1β、髓過氧化物酶(MPO)檢測 ELISA試劑盒購自Abcam公司；抗NF-κB p65抗體、抗TLR4抗體、抗HMGB1抗體購自Abcam公司。

1.3膿毒癥肺損傷大鼠模型的制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備膿毒癥肺損傷大鼠模型，具體操作：用10%水合氯醛麻醉大鼠后下腹正中切口開腹，環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，并在距離盲腸末端約1 cm處切開0.5 cm的切口，擠出糞便后回納盲腸入腹腔，常規(guī)縫合。高滲鹽霧化組在膿毒癥肺損傷模型制備成功后2 h給予霧化吸入高滲鹽水(0.9%氯化鈉注射液100 ml加入10%氯化鈉注射液30 ml配置成3%高滲鹽水130 ml)。假手術(shù)組打開腹腔后常規(guī)縫合。實驗過程中將造模不成功、死亡或因其他原因不符合要求的大鼠剔除；每組缺失大鼠通過隨機抽樣原則重新補齊，直到整個實驗結(jié)束。

1.4霧化吸入操作方法 將高滲鹽霧化組大鼠分批放入20 cm×30 cm×40 cm大小的玻璃箱中，用鉆孔器在玻璃箱前方正中開鑿一個直徑為2 cm的孔徑作為霧化進氣孔，在玻璃箱后方靠邊界處開鑿一個直徑約0.5 cm的孔徑作為排氣孔，將3%高滲鹽水10 ml加入超聲霧化器中，每次霧化吸入15 min，2次間隔3 h。術(shù)后正常進食水，分別在霧化吸入6、24 h時處死大鼠。

1.5肺組織病理改變 將大鼠麻醉處死后，以4%多聚甲醛溶液固定肺組織，在不同部位取3塊肺組織，依次以乙醇脫水，石蠟包埋、切片、脫蠟、染色，以肺泡壁毛細血管擴張充血程度、肺泡間隙增寬及炎性細胞滲出程度進行病理學評價。每只大鼠取4張切片，每張切片觀察6個不同視野，分別記錄病理學評分，最后取平均值。

1.6肺組織濕干重比(W/D)和MPO測定 切取3組大鼠右肺，試紙吸干肺組織表面血液及黏液后稱重記錄濕重；然后60℃烘干24 h稱重記錄干重，計算W/D比值。準確稱取肺組織，磷酸鹽緩沖液制備5%肺組織勻漿，40 000 r/min，30 min高速離心，棄上清，再加入磷酸鹽緩沖液超聲預處理90 s，37℃水浴15 min后再次離心，分光光度計測量樣本在490 nm處OD值，根據(jù)OD值換算MPO活性。

1.7血清炎性因子水平測定 取3組大鼠左心室血1 ml，放置室溫2 h，1000 r/min，20 min離心，取上清液置于-20℃保存，使用時逐漸恢復至20℃，與標準品混合，按ELISA試劑盒上的protocol操作。酶標儀450 nm比色，與標準品對應的比色值比較，計算大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.8肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1表達測定 取3組大鼠右肺，將肺組織放入勻漿器中充分研磨后，加入PMSF裂解液，于冰上孵育30 min后，以4℃，12 000 r/min，5 min高速離心后取上清，用蛋白標準品將樣本蛋白標準化，再按蛋白抽提試劑盒上protocol抽提細胞質(zhì)蛋白和核蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、分別加入NF-κB、TLR4、HMGB1一抗、孵育過夜、加入二抗孵育1 h后顯色定影，最后用Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參(β-actin)值。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學表現(xiàn) 假手術(shù)組支氣管結(jié)構(gòu)清楚，肺間質(zhì)可見少量炎性細胞浸潤，微血管無充血，肺泡內(nèi)無滲出。模型組肺泡腔內(nèi)大量滲出，肺泡間明顯增寬、塌陷，肺間質(zhì)內(nèi)浸潤大量炎性細胞，微血管充血、淤血。高滲鹽霧化組肺間質(zhì)炎性細胞浸潤較模型組減少，微血管淤血程度明顯減輕。見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織病理學表現(xiàn)(SP×400)

2.2肺組織損傷指標比較 與假手術(shù)組比較，模型組肺組織病理學評分、肺組織W/D值、MPO顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，高滲鹽霧化組肺組織病理學評分、肺組織W/D值、MPO顯著降低(P<0.01)。見表1、圖2。

圖2 3組大鼠肺組織損傷指標比較

表1 3組大鼠肺組織損傷指標比較

2.3血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，高滲鹽霧化組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著下降(P<0.01，P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 3組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

表2 3組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表達水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，高滲鹽霧化組HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)。見表3、圖4。

圖4 3組大鼠肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表達水平比較

表3 3組大鼠肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表達比較

3 討論

膿毒癥繼發(fā)ALI的發(fā)病機制十分復雜，主要病理生理學改變?yōu)榉尾慷喾N炎性細胞浸潤、移位，促炎因子和抗炎因子的表達改變；血管通透性增大，炎性分泌物產(chǎn)生，透明膜形成及凝血功能異常等[8]；引起肺順應性下降和通氣/血流比例失調(diào)[9]，導致通氣功能障礙，臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥和肺部滲出的增加[10]。生理狀態(tài)下，肺間質(zhì)、細支氣管及肺泡間隔中存在中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞，可吞噬進入下呼吸道的感染性、毒性及致敏性物質(zhì)[11]。HMGB1和NF-κB廣泛存在于細胞核內(nèi)，HMGB1可穩(wěn)定核染色體和調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯；NF-κB是核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的一種，負責前炎性因子和細胞生存基因的表達，在生理狀態(tài)下NF-κB與有抑制作用的IκB結(jié)合[12]。

既往研究證明，膿毒癥時大量炎性因子及內(nèi)毒素釋放入血，誘導肺組織內(nèi)中性粒細胞聚集、活化、釋放、延遲凋亡；同時促進巨噬細胞大量釋放HMGB1，當HMGB1與其內(nèi)源性配體TLR4在細胞外結(jié)合后會進一步激活MyD88依賴性途徑[13-14]。在炎性因子作用下，IκB磷酸化后活化，NF-κB與IkB形成的三聚體會發(fā)生降解，導致NF-κB脫離并激活，被激活的NF-κB能迅速到達細胞核的位置發(fā)揮自身作用；當HMGB1/TLR4/NF-κB/IκB信號通路被激活后會產(chǎn)生大量的IL-1β、IL-6、細胞因子和趨化因子、前炎性介質(zhì)(如TNF-α)等[15]。炎性因子和前炎性因子可直接損傷肺血管內(nèi)皮細胞，增加內(nèi)皮細胞的通透性，造成肺水腫；同時能刺激中性粒細胞釋放炎性介質(zhì)和正反饋促進HMGB1分泌，激發(fā)機體炎癥級聯(lián)反應從而加重ALI[16]。本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組肺泡腔內(nèi)大量滲出，肺泡間明顯增寬、塌陷，肺間質(zhì)內(nèi)浸潤大量的炎性細胞，微血管充血淤血等病理學改變；且模型組肺W/D值、肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著增加。說明膿毒癥可增加肺部炎癥浸潤程度；HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路被激活在膿毒癥肺損傷的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。

霧化吸入高滲鹽水在臨床上多用于治療囊泡性纖維癥和新生兒細支氣管炎，可能是通過減輕肺泡巨噬細胞活化、中性粒細胞聚集及細胞表面黏附因子表達來實現(xiàn)；同時提高氣道表面液體水平，改善氣道黏膜纖毛運輸效力[17]。小劑量靜脈輸入高滲鹽水溶液也用于失血及創(chuàng)傷性休克的液體復蘇。Mitra等[18]發(fā)現(xiàn)高滲鹽水可減少復蘇所需的液體量；還在模型細胞及模型動物水平上證實了高滲鹽水可通過抑制NF-κB-IκB通路影響幾種促炎細胞因子轉(zhuǎn)錄，從而起到保護作用。Wohlauer等[7]報道，在失血性休克動物模型中，早期容量復蘇時，應用霧化吸入高滲鹽水的措施，可通過減少內(nèi)皮細胞釋放炎性前介質(zhì)而起到減輕ALI的目的；其作用機制是在不改變中性粒細胞肺內(nèi)聚集情況下，降低了基質(zhì)金屬蛋白酶-13表達，保證了終末氣道肺泡基膜的完整性；基質(zhì)金屬蛋白酶-13已被證實與由敗血癥引起的ALI發(fā)展關(guān)聯(lián)。本實驗結(jié)果顯示，高滲鹽霧化組肺部炎癥程度、肺部W/D明顯減輕，血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達及肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達均下降，證實了霧化吸入高滲鹽水可能是通過HMGB1/TLR4/NF-κB途徑起到減輕肺部炎癥的作用。

霧化吸入高滲鹽水治療膿毒癥肺損傷效果好，鑒于該方法在臨床已應用于其他肺部疾病，安全性好且價格低廉，今后可在臨床推廣，以期為膿毒癥的治療提供更多有效方法。