陳正陽,孫培鳴,張 濤,徐冰心,孫宏偉,司少艷,周金蓮,楊建武,崔 彥

隨著我國載人航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，航天醫(yī)學研究備受關注[1-2]。研究證實，失重環(huán)境顯著影響人體的生理病理過程，這同時為我們研究腫瘤的生物學行為提供了一種新的思路[3]。據(jù)文獻報道，失重對腫瘤細胞的研究主要集中在甲狀腺癌、乳腺癌、結直腸癌和肺癌等；研究表明，微重力環(huán)境對腫瘤細胞的生理功能和超微結構有重要影響[4-7]。胃癌是世界第四位的常見癌癥，也是第二位的癌癥死亡原因[8]。本課題組前期進行模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞代謝組學影響的研究，發(fā)現(xiàn)微重力細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(the rotary cell culture system，RCCS)能夠顯著影響人HGC-27胃癌細胞脂類物質代謝，對HGC-27胃癌細胞的生理功能產生顯著影響[9]。本實驗研究RCCS模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞增殖、細胞周期、凋亡和相關蛋白及超微結構的影響，旨在進一步豐富航天醫(yī)學基礎理論，為航天環(huán)境及失重暴露后胃癌機制探討和防治提供研究思路。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 人HGC-27胃癌細胞系(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院)，微載體Cytodex-3(Sigma, USA)，旋轉細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Synthecon, USA)，透射電鏡(FEI Tecnai Spirit 120 kv USA)，流式細胞儀(FACSCalibur, BD, USA)，酶標分析儀(RT-6100, Rayto, USA)，鼠單抗Bcl-2，鼠單抗Fas，兔多抗Cyclin B1，鼠單抗Cyclin D1，小鼠單抗β-Actin，HRP標記羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗。

1.2人HGC-27胃癌細胞培養(yǎng)及分組 用RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco, USA)、10%胎牛血清(Gibco, USA)、1% 100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素(Gibco, USA)配制完全培養(yǎng)基，將人HGC-27胃癌細胞傳代后置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液3次。選取生長狀態(tài)較好、處于4～10代對數(shù)生長期細胞，隨機分為模擬微重力組(SMG)和正常重力對照組(NG)。SMG組細胞置于RCCS模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)；NG組細胞置于正常重力環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3建立人HGC-27胃癌細胞RCCS微載體培養(yǎng)體系 每個HARV(50 ml)底部有一層有機硅膜，將配置好的完全培養(yǎng)基和250 mg Cytodex-3微載體充分混勻后注入HARV。計數(shù)人HGC-27胃癌細胞數(shù)量，每個HARV中加入7×106個細胞。待HARV中加入的完全培養(yǎng)基接近充滿時，用塞子封閉注入口。用吸取完全培養(yǎng)基和空氣的5 ml注射器排空HARV中的氣泡，確認排盡氣泡后用乙醇棉球消毒塞子外表面。把HARV連接到RCCS系統(tǒng)中并置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱，HARV轉速設置為8 r/min。2組細胞在RCCS系統(tǒng)培養(yǎng)時間為1、3 d。

1.4樣本采集 用移液管將HARV中的細胞-微載體-完全培養(yǎng)基混合液體轉移至50 ml離心管中并靜置3 min，待細胞-微載體復合物沉淀后棄去含有完全培養(yǎng)基的上清液。加入PBS，并用移液管吹洗細胞-微載體復合物，充分吹洗后，棄去上清液。重復上述過程3次。隨后加入0.25%胰酶4 ml，置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱消化3 min。終止胰酶的消化后，1000 r/min離心5 min。用70 μm細胞篩過濾并1000 r/min 離心5 min后，獲得SMG組人HGC-27胃癌細胞。NG組細胞棄掉培養(yǎng)基、PBS沖洗、加入0.25%的胰酶3 ml消化和1000 r/min離心5 min后，獲得人HGC-27胃癌細胞。每組實驗均進行3次生物學重復。

1.5CCK-8法檢測細胞增殖 將培養(yǎng)1、3 d的NG組和SMG組細胞用PBS吹洗2次，1000 r/min離心5 min。配置100 μl的細胞懸液并加入到96孔板中。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(37℃, 5%CO2)。置于培養(yǎng)箱中24 h。向96孔板中加入CCK-8溶液10 μl。置于HERAcell 150i恒溫培養(yǎng)箱孵育4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.6流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

1.6.1細胞周期檢測：2組細胞經消化離心后，置于預冷75%乙醇中，然后置于4℃環(huán)境下(24 h)。把固定好的細胞用預冷PBS 吹洗2次，2000 r/min離心5 min，加入200 μl PBS，轉移至流式管中。每個流式管加入100 μl RNA酶，在37℃水浴消化30 min，加入PI溶液100 μl至終濃度100 μg/ml并用錫箔紙包住，避光4℃染色30 min后上機檢測。

1.6.2細胞凋亡檢測：2組細胞用不含EDTA的胰酶消化離心后用PBS吹洗2次，1000 r/min離心5 min。每個流式管中加入106個細胞，并用預冷的細胞著色緩沖液吹洗，接著用1×106/ml的Annexin V溶液重懸細胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC溶液，混勻后在4℃環(huán)境下避光放置15 min。最后加入10 μl PI溶液，混勻后在4℃環(huán)境下避光放置5 min；然后上機檢測。

1.7Western Blot法檢測周期蛋白(Cyclin D1和CyclinB1)和凋亡相關蛋白(Fas和Bcl-2)表達 按1 ml裂解液加10 μl PMSF(100 mmol/L)、10 μl磷酸酶抑制劑，搖勻置于冰上。每管加入80 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。裂解完后，用冷凍離心機12 000×g離心5 min。然后將上清液轉移到0.5 ml的EP管中，置于-20℃環(huán)境中保存。用BCA試劑盒(碧云天，中國)進行蛋白定量測定。將事先制備好的SDS-PAGE膠加入電泳槽中，在各膠孔中分別加入10 μl待檢測樣本，當loading buffer到達分離膠底部時結束電泳。然后轉膜時，夾的黑面對槽的黑面；夾的白面對槽的紅面，將其放入轉膜槽中，并排除氣泡，在電壓為80 V下，轉膜60 min。在轉膜結束后，用含5%的脫脂奶粉TBST室溫下封閉1 h，洗滌后加入一抗(Proteintech 公司，美國)，室溫下?lián)u床孵育1～2 h。在一抗孵育結束后，TBST洗滌3次，每次10 min。同樣的方法加入和處理二抗。將處理好的膜放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)，然后將發(fā)光液A液、B液按1∶1配好，均勻地滴在膜上。通過增強化學發(fā)光法檢測免疫印跡。

1.8透射電鏡觀察細胞器的變化 NG組和SMG組的細胞消化離心后獲得單細胞團。向單細胞團中加入2.5%戊二醛直至沒過離心管，并在室溫下固定2 h。用移液器棄去2.5%戊二醛，接下來加入1%鋨酸，并在室溫下固定2 h。用50%、70%、90%、100%乙醇、100%丙酮依次脫水。樹脂包埋、切片，最后用透射電鏡觀察。

2 結果

2.1細胞增殖比較 與NG組相比，SMG組第1、3天人HGC-27胃癌細胞的增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同時相的SMG組細胞增殖能力明顯不同，與第1天相比，SMG組人HGC-27胃癌細胞的增殖能力在第3天后顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞增殖能力的影響

2.2細胞周期 與NG組相比，SMG組第1天和第3天G0/G1期細胞比例顯著減少，而G2/M期細胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2組S期細胞比例在第1天比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，第3天后SMG組S期細胞比例較NG組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2A、2B。與NG組相比，SMG組第 1、3 天Cyclin D1和Cyclin B1表達水平顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2C。

圖2 模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞周期的影響

2.3細胞凋亡 與NG組相比，第1、3天SMG組Fas表達水平顯著增加，Bcl-2表達水平顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與NG組相比，SMG組第1、3天凋亡細胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞凋亡的影響

2.4細胞超微結構 NG組第1天和第3天胞質內粗面內質網(wǎng)、線粒體形態(tài)、細胞膜、核仁均正常；SMG組第1天細胞器的變化與NG組第1天的類似。SMG組第3天細胞膜結構、線粒體形態(tài)、細胞膜、核仁正常，但胞質內粗面內質網(wǎng)腫脹明顯、胞質中細胞空泡結構明顯增加，其中，白色箭頭所指的分別是腫大的粗面內質網(wǎng)和空泡結構。見圖4。

圖4 模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞超微結構的影響

3 討論

HGC-27細胞是日本學者Tadaatsu Akagi于1973年從1例未分化胃癌患者切除的淋巴結轉移灶取材所建立的人未分化胃癌細胞系，細胞呈多角形或短梭形，以單層的形式貼壁生長，倍增時間為17 h；從形態(tài)上看，HGC-27細胞缺乏明顯的腺癌細胞特征，鏡下可見胞質內充滿黏液，細胞核被擠壓一邊并呈“印戒”樣；該細胞中三磷腺苷、乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性較高。研究表明，HGC-27胃癌細胞是一種理想的實驗細胞[10]。

本實驗結果顯示，RCCS模擬微重力顯著影響了人HGC-27胃癌細胞的生理功能，SMG組第1、3天HGC-27胃癌細胞的增殖能力顯著降低，G0/G1期細胞比例減少，G2/M期細胞比例增加，Cyclin D1和Cyclin B1表達減少。根據(jù)文獻報道，用RCCS或RPM來模擬微重力時，CDK1、CDK2、CDK4、CCND1和CCNB1的mRNA在DLD-1大腸癌細胞表達減少[11-12]。姜楠等[13]研究了失重對乳腺癌細胞的影響，其研究結果顯示，RCCS模擬微重力環(huán)境下人MDA-MB-231乳腺癌細胞的超微結構發(fā)生明顯變化，細胞內次級溶酶體明顯增多，G0/G1期細胞比例減少，S期細胞比例增加，細胞凋亡增加。Cyclin D1和Cyclin B1在G1/S期和在G2/M期轉換中起著重要作用。Cyclin D1是CCND1編碼的一種蛋白，具有促進G1到S期轉化的作用；Cyclin B1是第1個被發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白，主要調節(jié)G2到M期的轉化，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)存在Cyclin B1表達異常，與腫瘤侵襲、轉移以及預后相關[14]。結合文獻認為在RCCS微重力環(huán)境中，HGC-27胃癌細胞的細胞周期蛋白Cyclin D1和Cyclin B1表達減少，致使G2/M期阻滯，細胞增殖能力降低，而S期細胞比例增加可能與實驗中失重暴露時間過短有關。

本實驗結果顯示，在RCCS系統(tǒng)培養(yǎng)第1、3天后，SMG組人HGC-27胃癌細胞的凋亡顯著增加，凋亡蛋白Fas表達水平顯著增加；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達則顯著減少，并且隨RCCS模擬失重培養(yǎng)時間的延長，人HGC-27胃癌細胞的凋亡更顯著。表明人HGC-27胃癌細胞在微重力環(huán)境中出現(xiàn)凋亡加重現(xiàn)象，這與本課題組前期對乳腺癌細胞的研究結果及其他學者對相關腫瘤細胞的研究結果一致，包括MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞、ML-1和ONCO-DG1甲狀腺癌細胞、DLD-1大腸癌細胞和U251神經膠質瘤細胞等[6,13,15-18]。林晶晶等[19]研究失重對HaCaT細胞的影響，結果表明失重作為一種特殊因素可通過Caspase途徑誘發(fā)細胞凋亡。因此微重力環(huán)境通過多種途徑能促使腫瘤細胞加劇凋亡，這對腫瘤細胞的失重應激反應具有重要意義。

本課題組還觀察到，HGC-27胃癌細胞經RCCS系統(tǒng)培養(yǎng)3 d后，超微結構發(fā)生明顯變化，粗面內質網(wǎng)腫脹，空泡結構增加。內質網(wǎng)對細胞物質的合成代謝至關重要，是一系列重要的生物大分子包括蛋白質、脂類和糖類合成的重要場所。本課題組前期進行模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞代謝組學影響的研究，發(fā)現(xiàn)RCCS模擬微重力顯著影響人HGC-27胃癌細胞脂類物質的代謝，使磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、花生四烯酸和鞘氨酸在SMG組中顯著上調，而神經鞘磷脂、磷脂酸、L-脯氨酸、肌酸、泛酸、氧化性谷胱甘肽、二磷酸腺苷和三磷腺苷顯著下調，這些物質對人HGC-27胃癌細胞的生理功能產生顯著的影響，進而影響到細胞增殖、周期和遷移等功能[9]。進一步印證了失重對HGC-27胃癌細胞的影響發(fā)生在超微結構層面和代謝組學水平。

綜上所述，RCCS模擬微重力能夠顯著影響人HGC-27胃癌細胞的增殖、生長周期、凋亡及超微結構。失重對HGC-27胃癌細胞的研究結果，對豐富航天醫(yī)學基礎理論、為航天員長期駐留太空的醫(yī)學保障思路，以及探討失重特殊環(huán)境影響胃癌細胞病理機制等具有重要意義。