吳文欣，吳海燕，楊雨晴，馮文紅，許洋溢，刁迎珠，汪寅，張志強(qiáng)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥230036)

植物血凝素(phytohemagglutinin-P，PHA-P)是一種從紅腎豆Phaseolus vulgaris中提取出來(lái)的有絲分裂原，外源注射該抗原后，被注射部位可產(chǎn)生腫脹反應(yīng)，腫脹程度逐漸達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降，最初用于反映家禽和鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(Goto et al.，1978;Smits et al.，1999)，因操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，在小型哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物研究中也有較多應(yīng)用(Brock et al.，2014;張志強(qiáng)，2015;Zhang et al.，2017)，但對(duì)爬行動(dòng)物的研究很少(Zimmerman et al.，2010;Finger et al.，2013)。脊椎動(dòng)物對(duì)PHA-P 的反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜多樣，免疫系統(tǒng)的天然免疫、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免疫等多個(gè)組分都可能參與該反應(yīng)過(guò)程(Martin et al.，2006;Brock et al.，2014;Zamora-Camacho，2019)，反應(yīng)峰值可被前移或延遲，隨季節(jié)(Merlo et al.，2014)、繁殖狀態(tài)(張志強(qiáng)等，2015)和發(fā)育階段(高慧清等，2017;張志強(qiáng)等，2020)等因素變化而變化。

紅耳龜Trachemys scripta elegans是對(duì)我國(guó)生態(tài)系統(tǒng)有嚴(yán)重危害的一種入侵物種，22～32℃是最適宜其生存的溫度范圍(周婷，1997)。紅耳龜稚龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)在注射后3 h和6 h都高于中華草龜 Chinemys reevesii(周贊等，2016)，成體對(duì)PHA-P的反應(yīng)峰值隨季節(jié)而變化(Zimmerman et al.，2010)，但關(guān)于PHA-P反應(yīng)峰值與血液指標(biāo)的關(guān)系以及溫度對(duì)PHA-P反應(yīng)模式的影響，尚無(wú)研究。本文在22℃條件下，篩選了適用于紅耳龜研究使用的最適PHA-P溶液注射濃度，確定了反應(yīng)峰值與血液指標(biāo)的關(guān)系，并進(jìn)一步比較了20℃、24℃、28℃和32℃處理6周后，紅耳龜對(duì)PHA-P反應(yīng)模式和峰值的影響，旨在為龜類(lèi)免疫生態(tài)學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用紅耳龜于2019年6月購(gòu)自安徽省合肥市裕豐花市，共72只，體質(zhì)量為101.3 g±2.7 g，不區(qū)分性別，塑料箱(長(zhǎng)60 cm×寬36 cm×高36 cm)飼養(yǎng)，共8箱，每箱10只或8只(各4箱)?？照{(diào)控制室溫為24℃ ±1℃，加熱棒控制箱體內(nèi)水溫為22℃ ±1℃，水深約10 cm，石塊壓箱，部分石塊露于水面。以市售龜糧飼喂，每隔2 d換曝氣24 h以上的自來(lái)水一次。室內(nèi)暫養(yǎng)15 d后，測(cè)其體質(zhì)量，分組備用。

1.2 PHA-P最適注射濃度的確定

選擇每箱10只紅耳龜3箱，任一箱中都以后足第二趾和第三趾交界處對(duì)應(yīng)的足墊部位作為注射部位，一側(cè)后足注射濃度為 1.0 g·L－1、2.5 g·L－1或 5.0 g·L－1的 PHA-P 溶液 100 μL，對(duì)側(cè)后足注射等量滅菌后的0.7%生理鹽水。水溫控制為22℃ ±1℃，注射前后均用70%乙醇消毒足墊部位。為連續(xù)監(jiān)測(cè)注射前后足墊厚度(瑞士Tesa數(shù)顯卡尺，±0.01 mm)的變化情況，參照Finger等(2013)和Zhang等(2017)設(shè)定測(cè)量時(shí)間點(diǎn):注射前(0 h)和注射后 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h。每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)每只龜由同一人重復(fù)測(cè)定3次。用左、右足皮膚組織增厚的百分率來(lái)表示紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)，即紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)(%)=(注射PHA-P的一側(cè)足墊部位的厚度－對(duì)側(cè)注射等量生理鹽水的足墊部位的厚度)×100/對(duì)側(cè)注射等量生理鹽水的足墊部位的厚度。以峰值明顯且用量經(jīng)濟(jì)為標(biāo)準(zhǔn)，選取最適注射濃度(高慧清等，2017;彭兵龍等，2019)。

1.3 PHA-P反應(yīng)峰值與各型白細(xì)胞百分比和血漿殺菌能力的關(guān)系

在最適PHA-P注射濃度條件下處理10只紅耳龜，注射前(0 h)和對(duì)PHA-P的反應(yīng)達(dá)峰值時(shí)，分別用一次性注射器(1 mL)從其背甲下靜脈竇采血，每次每只龜采血約0.3 mL，取20 μL血液制作血涂片2張，剩余血液置于經(jīng)肝素鈉處理后的離心管內(nèi)，離心后留測(cè)血漿殺菌能力。使用快速瑞氏吉姆薩染液(南京建成生物工程有限公司，產(chǎn)品編號(hào):D010)處理血涂片，鑒別和計(jì)數(shù)血液中嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比;參照對(duì)中華蟾蜍Bufo gargarizans(彭兵龍等，2019)和黑線(xiàn)倉(cāng)鼠Cricetulus barabensis(Zhang＆Zhao，2015)血清殺菌能力的測(cè)定方法測(cè)定紅耳龜血漿殺菌能力。將大腸桿菌Escherichia coli干粉(廣東省微生物菌種保藏中心，ATCC#8739)制成細(xì)菌液，激活后稀釋成細(xì)菌工作液，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定細(xì)菌的最適工作液濃度;同時(shí)，將10 μL 血漿樣品加入200 μL 含有 2.34 mg L-谷氨酸鹽的非 CO2依賴(lài)的培養(yǎng)基(Invitrogen，Gibco Media#18045)中混勻，添加最適細(xì)菌工作液20 μL后，再次混勻并37℃孵育30 min，之后每板50 μL樣品涂胰蛋白酶大豆瓊脂糖平板，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)。陰性對(duì)照組不添加血漿樣品，孵育液全部為液體培養(yǎng)基，每一批次均設(shè)置3個(gè)陰性對(duì)照平板。平板倒置，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育至24 h時(shí)，取出計(jì)數(shù)。陰性對(duì)照組的菌落范圍數(shù)為52～234個(gè)/平板。血漿殺菌能力(%)=(1－每個(gè)樣品的菌落數(shù)/陰性對(duì)照組的平均菌落數(shù))×100%。

1.4 溫度對(duì)PHA-P反應(yīng)模式和峰值的影響

將32只紅耳龜分成4組，分別在20℃、24℃、28℃和32℃下飼養(yǎng)6周后，左后足足墊部位注射最適濃度的PHA-P溶液，右后足足墊部位注射等量的生理鹽水溶液，測(cè)定注射前(0 h)和注射后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 的足墊部位厚度，并測(cè)定不同溫度組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)的體質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較不同PHA-P注射濃度組、不同溫度組體質(zhì)量的組間差異，以及不同濃度、不同溫度最大PHA-P反應(yīng)的組間差異。以不同濃度的PHA-P溶液或不同溫度作為組間因子，注射前(0 h)和注射后 6 h、12 h、24 h、48 h 和 72 h等時(shí)間點(diǎn)為組內(nèi)因子，用重復(fù)測(cè)量方差分析(repeated measurement ANOVA)比較不同濃度組之間或不同溫度下紅耳龜對(duì)PHA-P反應(yīng)的差異情況，以及同一濃度內(nèi)或同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)之間的差異。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較注射前(0 h)和注射后到達(dá)反應(yīng)峰值時(shí)各型白細(xì)胞的百分比和血漿殺菌能力的差異。文中數(shù)值均以E表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅耳龜?shù)腜HA-P最適注射濃度

1.0 g·L－1、2.5 g·L－1和5.0 g·L－1濃度組紅耳龜注射前(0 h)的初始體質(zhì)量分別為124.4 g±5.6 g、121.5 g±4.7 g和112.0 g±2.8 g，72 h后的終止體質(zhì)量分別為122.4 g±5.5 g、119.6 g±5.3 g和110.4 g±2.9 g，組間及同一組內(nèi)0 h和72 h之間的體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果表明，1.0 g·L－1、2.5 g·L－1和5.0 g·L－1濃度組對(duì) PHA-P 的反應(yīng)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F2，27=0.173，P＞0.05)，但不同濃度組對(duì)PHA-P的反應(yīng)隨時(shí)間點(diǎn)變化明顯(F5，135=27.990，P ＜0.05):1.0 g·L－1濃度組的反應(yīng)值在24 h顯著高于6 h和72 h(F5，45=6.298，P ＜ 0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2.5 g·L－1濃度組的反應(yīng)值在48 h最高，24 h其次，都顯著高于 0 h、6 h和 72 h(F5，45=12.759，P ＜ 0.05);5.0 g·L－1濃度組的反應(yīng)值在24 h最高，48 h其次，都顯著高于0 h(F5，45=12.367，P ＜ 0.05)。1.0 g · L－1、2.5 g·L－1和 5.0 g·L－1濃度組分別在注射后24 h、48 h和24 h達(dá)到反應(yīng)峰值，增厚的百分比分別為6.83% ±1.53%、7.81% ±1.48%和8.63% ±0.62%，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F2，27=0.499，P＞0.05)(表1)。依據(jù)反應(yīng)明顯且用量經(jīng)濟(jì)的原則，選取2.5 g·L－1為最適注射濃度。

表1 不同注射濃度組紅耳龜對(duì)植物血凝素的反應(yīng)比較Table 1 Comparisons of phytohemagglutinin-P response among different injection dose groups

2.2 PHA-P反應(yīng)峰值與各型白細(xì)胞百分比和血漿殺菌能力的關(guān)系

獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，2.5 g·L－1濃度組紅耳龜注射前(0 h)和48 h的體質(zhì)量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，48 h時(shí)對(duì)PHA-P的反應(yīng)值和淋巴細(xì)胞的百分比都顯著高于0 h(P＜0.05)，但嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比，以及嗜中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值和血漿殺菌能力在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

2.3 溫度對(duì)PHA-P反應(yīng)模式和峰值的影響

20℃、24℃、28℃和32℃組紅耳龜?shù)某跏俭w質(zhì)量分別為74.7 g±6.4 g、92.2 g±4.9 g、81.0 g±5.9 g和78.3 g±3.6 g，6周后的終止體質(zhì)量分別為111.1 g±1.6 g、126.5 g±4.6 g、117.7 g±3.2 g和110.6 g±5.0 g，體質(zhì)量分別增加55.0% ±11.3%、39.5% ±8.3%、50.7% ±11.5%和42.5% ±7.0%，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

20℃組對(duì)PHA-P的反應(yīng)值在48 h最高，顯著高于0 h 和6 h(F5，42=4.231，P ＜0.05)，但與其他時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;24℃組對(duì)PHA-P的反應(yīng)值在注射后24 h最高，48 h與24 h接近，都顯著高于 0 h、6 h 和 72 h(F5，42=7.730，P ＜0.05);28℃組的反應(yīng)值在注射后24 h最高，48 h與24 h接近，都顯著高于 0 h(F5，42=5.406，P ＜0.05);32℃組的反應(yīng)值在注射后24 h最高，48 h其次，24 h顯著高于0 h 和6 h(F5，42=4.881，P ＜0.05)。20℃、24℃、28℃和32℃組對(duì)PHA-P的反應(yīng)的最高值之間也無(wú)明顯的組間差異(F3，28=0.840，P＞0.05)(表3)。

表2 紅耳龜對(duì)植物血凝素的反應(yīng)峰值與各型白細(xì)胞百分比和血漿殺菌能力的關(guān)系Table 2 The relationship between maximal phytohemagglutinin-P response，different subtypes of leukocyte，and plasma bactericidal capacity in Trachemys scripta elegans

表3 不同溫度組紅耳龜對(duì)植物血凝素的反應(yīng)比較Table 3 Comparisons of phytohemagglutinin-P response among different temperature groups

3 討論

3.1 紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)的最適濃度選擇及反應(yīng)機(jī)制

22℃下，亞成體紅耳龜?shù)捏w質(zhì)量與中華蟾蜍相似(Zhang et al.，2017;彭兵龍等，2019)，因此足墊部位選用了相同的100 μL的注射劑量，經(jīng)分別為 1.0 g·L－1、2.5 g·L－1和 5.0 g·L－1PHA-P 溶液注射后，反應(yīng)峰值分別出現(xiàn)于注射后24 h、48 h和24 h，但各濃度組的峰值無(wú)明顯差異。從節(jié)省試劑和便于實(shí)踐操作的角度考慮，紅耳龜對(duì)PHA-P反應(yīng)的最適注射濃度確定為2.5 g·L－1。除足墊外，趾蹼也被選擇用于外源注射PHA-P溶液，如32℃下對(duì)3月齡灣鱷Crocodylus porosus的研究表明，趾蹼注射 PHA-P 溶液20 μL，注射后 12 h，1.0 g·L－1和2.0 g·L－1PHA-P溶液組達(dá)到峰值，注射后24 h，5.0 g·L－1PHA-P溶液組達(dá)到峰值，對(duì)幼鱷而言，2.0 g·L－1PHA-P溶液為最適注射濃度(Finger et al.，2013)。紅耳龜和灣鱷都為爬行動(dòng)物，但對(duì)PHA-P反應(yīng)的最適濃度和劑量不同，這可能與灣鱷為幼鱷、體質(zhì)量小，而紅耳龜為亞成體、體質(zhì)量較大有關(guān)。雖然PHA-P反應(yīng)無(wú)明顯的劑量依賴(lài)性，但通過(guò)被注射部位和體質(zhì)量的大小來(lái)確定合適的注射劑量仍是可取的。

紅耳龜在最適注射濃度條件下達(dá)反應(yīng)峰值時(shí)，血液中只檢出淋巴細(xì)胞的百分比顯著升高，這與中華蟾蜍對(duì)PHA-P的反應(yīng)相似，但后者血液中嗜酸性粒細(xì)胞的百分比也顯著下降(彭兵龍等，2019)。目前，關(guān)于爬行動(dòng)物對(duì)PHA-P反應(yīng)的機(jī)制性基礎(chǔ)研究，僅見(jiàn)于灣鱷，即在注射PHA-P后12 h，灣鱷趾蹼部位皮膚組織中除淋巴細(xì)胞的數(shù)量外，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量也都高于對(duì)照組(Finger et al.，2013)。淋巴細(xì)胞分為T(mén)細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞:T細(xì)胞受抗原刺激激活后，參與細(xì)胞免疫，B細(xì)胞激活后與體液免疫有關(guān)(Davis et al.，2008)。紅耳龜在注射PHA-P抗原后，腫脹程度主要與獲得性免疫能力有關(guān)。

3.2 溫度對(duì)紅耳龜PHA-P反應(yīng)模式的影響

經(jīng)外源注射PHA-P抗原后引起的腫脹反應(yīng)，雖然反應(yīng)機(jī)制不同，可能并不完全等同于更強(qiáng)的免疫功能，但作為反映脊椎動(dòng)物健康狀態(tài)的一個(gè)近似指標(biāo)，仍適用于同一物種不同環(huán)境條件下的比較研究(張志強(qiáng)，2015;Zamora-Camacho，2019)。季節(jié)性環(huán)境條件下，從4月底至9月初氣溫逐漸升高，但紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)峰值卻在5月底最高，9月初其次，說(shuō)明紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)不只受溫度影響，也可能受病原體、食物可利用性等其他因素影響(Zimmerman et al.，2010)。本文選定的20℃、24℃、28℃和32℃與紅耳龜22～32℃的適宜生存溫度范圍大體上相匹配(周婷，1997)，20℃組紅耳龜對(duì) PHA-P的反應(yīng)值在注射后48 h最高，24℃組、28℃組和32℃組在注射后24 h時(shí)最高，隨溫度升高，PHA-P反應(yīng)的峰值前移，但無(wú)明顯的組間差異;達(dá)反應(yīng)峰值時(shí)，紅耳龜血液中淋巴細(xì)胞的百分比增加明顯，說(shuō)明升溫可提前激活細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和/或體液免疫反應(yīng)。溫度對(duì)龜鱉類(lèi)動(dòng)物的天然免疫和獲得性免疫影響不同。例如，28.8℃能顯著提升紅耳龜B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，但對(duì)其吞噬功能無(wú)明顯影響(Palackdharry et al.，2017;Zimmerman et al.，2017);在恒定溫度28℃和波動(dòng)溫度(28±2)℃條件下孵化的中華鱉Pelodiscus sinensis卵，波動(dòng)溫度孵化條件下的新生中華鱉幼體對(duì)細(xì)菌的抵抗能力更強(qiáng)，但對(duì)PHA-P的反應(yīng)與恒定溫度組的差異不顯著(吳瓊等，2017)。此外，脊椎動(dòng)物對(duì)PHA-P的反應(yīng)也受特定生活史階段的影響。例如，花背蟾蜍Pseudepidalea raddei 42期蝌蚪對(duì)PHA-P的反應(yīng)為反應(yīng)迅速、持續(xù)時(shí)間短的單峰值，其他水生階段反應(yīng)峰值有后延現(xiàn)象，且在登陸后對(duì)PHA-P的反應(yīng)峰值強(qiáng)度下降、持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，這可能與陸地多變的環(huán)境條件有關(guān)(高慧清等，2017);與非繁殖期、妊娠期和斷乳期相比，黑線(xiàn)倉(cāng)鼠哺乳期對(duì)PHA-P的反應(yīng)峰值后延，這對(duì)其存活可能不利，但有助于繁殖進(jìn)程的延續(xù)和后代的生長(zhǎng)發(fā)育(張志強(qiáng)等，2015)。紅耳龜亞成體對(duì)溫度變化有較強(qiáng)的耐受性，16～36℃下單位體質(zhì)量的靜止代謝率隨溫度升高而增加(劉哲，2015)，在適宜的溫度范圍內(nèi)，紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)峰值隨溫度升高前移，這有利于動(dòng)員和激活細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，提高紅耳龜?shù)倪m應(yīng)能力，可能是全球氣候變化背景下紅耳龜易于擴(kuò)散的生理基礎(chǔ)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)紅耳龜對(duì)PHA-P反應(yīng)的最適注射濃度為 2.5 g·L－1，劑量為 100 μL，對(duì) PHA-P的反應(yīng)峰值與淋巴細(xì)胞的百分比有關(guān)，反應(yīng)峰值隨溫度升高而前移。然而，紅耳龜對(duì)PHA-P的反應(yīng)只能部分反映其免疫功能的變化情況。作為嚴(yán)重危害我國(guó)生態(tài)系統(tǒng)安全的生物入侵種，關(guān)于紅耳龜擴(kuò)散能力與天然免疫、獲得性免疫等免疫系統(tǒng)不同組分之間的關(guān)系，仍有待于深入研究。