宋文皓，劉丹梅，楊君

(1.遼東學院農(nóng)學院，遼寧丹東118000;2.四川農(nóng)業(yè)大學動物與科技學院，成都611130;3.大連理工大學生物工程學院，遼寧大連116024)

柞蠶Antheraea pernyi屬鱗翅目Lepidoptera天蠶蛾科Saturniidae，是一種完全變態(tài)昆蟲，其地理種群、生態(tài)類型有上百種，分布在我國10多個省(姜義仁，秦利，2011;劉丹梅等，2019)。柞蠶作為一種野外養(yǎng)殖的經(jīng)濟型昆蟲，為我國經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)民致富做出了重大貢獻(徐曉男，2019)。柞蠶蠶絲蛋白對生物醫(yī)學應用具有很大的潛在價值(Silva et al.，2019)。柞蠶膿病是由柞蠶核型多角體病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus，ApNPV)引起的，是柞蠶養(yǎng)殖的主要病害，主要發(fā)生在幼蟲期和蛹期，染病后的小蠶體和蛹出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀(趙江濤，2018)。由于蠶種、氣象、病原等多種因素，柞蠶膿病容易爆發(fā)，一般年份危害率約15%，大爆發(fā)年份發(fā)病率可達80%以上。柞蠶膿病目前尚無良藥可防治，預防措施以消毒為主(徐國東，2013;夏潤璽，秦利，2015;趙江濤，2018)。該病的爆發(fā)會大大減損蠶農(nóng)養(yǎng)蠶的積極性，使柞蠶的生產(chǎn)及研究嚴重受限(魏慶國等，2009;張金福，2017)。

免疫卵黃抗體(egg yolk immunoglobulin，IgY)技術(shù)是利用高產(chǎn)母雞接受細菌、病毒等外來微生物抗原的剌激后產(chǎn)生免疫應答反應，生成相應抗體且主要富積在雞蛋蛋黃中的特點，以產(chǎn)蛋母雞作為生物反應器，大量連續(xù)生產(chǎn)特異性卵黃抗體的技術(shù)(Rǜdiger et al.，2004;李曉宇等，2014;王業(yè)華等，2019)。IgY被美國 FDA認定為“公認安全類(GRAS)”物質(zhì)。由于IgY不在獸藥或生物制品管理范疇內(nèi)，生產(chǎn)和應用無需批準文號(李曉宇等，2014)，且更加經(jīng)濟實用、綠色高效、免疫原性強、操作便捷、費用低，作為一種具有諸多優(yōu)勢的飼料添加劑發(fā)展迅速(邱濤濤等，2019;王業(yè)華等，2019)。研究表明，在家蠶Bombyx mori膿病病毒(何麗華等，2003)、抗豬流行性腹瀉病毒(覃有曼，2019)和大口黑鱸Micropterus salmoides彈狀病毒(袁雪梅等，2019)等的卵黃抗體技術(shù)都取得都了良好的預防或治療效果。本研究建立了抗ApNPV IgY有效制備的較為完整的技術(shù)體系，用酶聯(lián)免疫試驗鑒定了存在抗原和抗體反應并測定了其效價，通過飼喂試驗對IgY預防柞蠶膿病的效果進行了探討，為柞蠶膿病的防治探索了一條新途徑。

1 材料及方法

1.1 材料及主要試劑

蒙古櫟Quercus mongolica又稱柞樹，柞樹葉和柞蠶品種青6號由遼寧省蠶業(yè)科學研究所提供。140日齡蛋雞由大連天德牧業(yè)有限公司提供。

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma-Aldrich公司。滅活疫苗組抗原使用雙推法(吳瓊，2013)乳化制成疫苗，冰箱冷藏室保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫卵黃抗體的制備和效價測定 采用皮下肌肉注射滅活疫苗免疫蛋雞獲得抗ApNPV IgY。采集靜脈血，收集血清。在第一次免疫后每周取蛋，第4周進行第三次免疫后，每日取蛋，收集卵黃，用蒸餾水稀釋成IgY水溶性組分，以最適抗原濃度進行包被，檢測免疫卵黃中的特異性卵黃抗體效價隨時間的變化，測定第7天、第14天、第21天、第28天的IgY效價，4周后測定每天的IgY效價。其中最適包被濃度選擇陽性對照OD450/630=0.8，且陰性對照OD450/630＜0.1的抗原稀釋液。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 使用最佳包被濃度的病毒液包被，4℃過夜，清洗后37℃封閉2 h。清洗后，將不同免疫周次收集的免疫卵黃水溶性組分按適當比例倍比稀釋制成一抗，PBS作空白對照，陰性對照組免疫卵黃水溶性組分按對應實驗組稀釋比例進行稀釋，加入98孔酶標版，溫育。清洗，加入1∶5 000倍稀釋的兔抗雞 IgG-HRP，溫育。清洗，加入TMB(底物)單組份顯色液，室溫避光顯色20 min。每孔迅速加入終止液50 μL。用酶標儀檢測，選擇實驗組OD值為陰性對照組，平均值2.1倍條件下的稀釋倍數(shù)作為抗體效價。

1.2.3 安全性試驗 將5 mL稀釋50倍的最高效價的IgY涂抹到每片柞樹葉上，陰干后分別給1～3齡蠶添食1次，4齡蠶添食2次，5齡蠶添食3次。飼喂抗體葉的為添食組，飼喂未處理的柞樹葉的為空白對照組。

1.2.4 飼喂試驗 檢測最高效價下IgY不同稀釋倍數(shù)和同時添食IgY對柞蠶膿病的防治效果。將最高效價IgY一定倍數(shù)的稀釋液涂抹在葉片上，陰干后制成抗體葉;陰干后再涂上ApNPV液，制成抗體-病毒的混合葉。

不同稀釋倍數(shù)的IgY對柞蠶膿病的防治效果方案見表1，將最高效價的卵黃分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋 0、16、32、64、128、256 倍，制成抗體-病毒混合葉飼喂柞蠶;繼續(xù)將發(fā)病率最低的稀釋倍數(shù)的卵黃作為A組，同時設置只添加PBS的非免疫卵黃對照B組、只涂抹ApNPV的病毒葉的攻毒對照C組和正常飼養(yǎng)的空白對照D組。添食IgY的試驗方案見表2，處理方式1完成后給葉方式更換為處理方式2。每組設3個重復，均在不同的蠶箱分開飼養(yǎng)。

表1 不同稀釋倍數(shù)的免疫卵黃抗體對柞蠶膿病防治試驗方案Table 1 Protocol of prevention and treatment of ApNPV disease with IgY of different dilution times

表2 同時添食免疫卵黃抗體對柞蠶膿病防治試驗方案Table 2 Protocol of prevention and treatment of ApNPV disease by adding IgY simultaneously

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗至少進行3次，每次3個生物學重復。采用獨立樣本t檢驗對各組進行比較。數(shù)據(jù)由GraphPad Prism計算，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原最適包被濃度的確定

當抗原濃度為 1.0 μg·mL－1且陽性對照為1∶4 000 時，OD450/630值最接近0.8(圖1)，且此時陰性對照的 OD450/630=0.054。因此，選取1.0 μg·mL－1作為最適包被濃度。

圖1 抗原最適包被濃度Fig.1 Optimal concentration of antigen coating

2.2 IgY效價測定及安全性試驗

免疫后的卵黃抗體效價升高，并且從第三次免疫開始抗體效價顯著上升，第6周、第7周、第8周效價達到最高值(1∶210)并保持不變，隨后效價開始下降(圖2:A)。因此，選定最高效價時的卵黃，在柞蠶飼喂試驗中制備復合飼料。

安全性試驗結(jié)果表明，免疫卵黃組和對照組所有重復區(qū)蠶的死籠率低、繭層率和結(jié)繭率良好(圖2:B～D)，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，蠶體無任何異常癥狀。

2.3 抗ApNPV IgY對柞蠶飼喂試驗

制備6～8周的雞源IgY，效價為1∶210，進行飼喂試驗。

2.3.1 不同稀釋倍數(shù)的IgY對柞蠶膿病的防治效果 稀釋倍數(shù)為64倍時的發(fā)病率最低，僅1.67%，其他稀釋倍數(shù)的發(fā)病率分別為:0倍13.33%、16倍13.33%、32倍 11.67%、128倍 3.33%和 256倍13.33%(圖3:A)。同時非免疫卵黃對照組和空白對照組無發(fā)病蠶，證明柞蠶良好，添食方式正確，攻毒對照組中柞蠶膿病發(fā)病率達98.33%，64倍卵黃稀釋液發(fā)病率極顯著降低(P＜0.000 1)(圖3:B)。

2.3.2 同時添食IgY對柞蠶膿病的防治效果A'組發(fā)病率為 10%、B'組為 5%、C'組為3.33%、D'組為83.33%，攻毒對照組和空白對照組分別為100%和 0%(圖 3:C)。A'、B'、C'組的發(fā)病率與攻毒對照組之間的差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.000 1)。同時，與攻毒對照組相比，D'組的發(fā)病率也顯著降低(P＜0.05)。

3 結(jié)論與討論

圖2 免疫卵黃抗體效價和安全性試驗結(jié)果Fig.2 IgY titer and security test results

圖3 免疫卵黃抗體飼喂試驗結(jié)果Fig.3 The results of feeding test of anti-ApNPV IgY

卵黃抗體能夠很好地中和特定病毒(張璐等，2017)，相較于其他抗體具有一些顯著的優(yōu)勢:外來抗原的需求量較小(高嶺，2014)、產(chǎn)蛋雞有較長的周期可產(chǎn)生抗體(Edzard et al.，2012)、抗體量較大且成本低、避免了動物應激反應、化學性質(zhì)穩(wěn)定等(高嶺等，2013)。柞蠶膿病發(fā)生給蠶養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的困難。由于缺乏特效藥物，目前主要是一些消毒手段，操作繁瑣、預防不徹底、經(jīng)濟效益低，并且卵黃抗體技術(shù)在柞蠶膿病防治方面的研究和應用匱乏。特異性卵黃抗體的有效制備存在安全性問題和技術(shù)難點，如IgY最適包被濃度、抗體效價、卵黃抗體稀釋倍數(shù)、對特定物種的飼喂方式。本研究采用ApNPV抗原免疫蛋雞制備的特異性多克隆卵黃抗體，通過合理的飼喂可使柞蠶膿病發(fā)病率降低，是預防柞蠶膿病的良好生物制品。

本研究用滅活的ApNPV免疫產(chǎn)蛋母雞收集卵黃，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定卵黃抗體效價，并利用合適效價的卵黃制備柞蠶飼喂試驗的復合飼料。選擇純化ApNPV的OD值為0.396，在免疫效果最佳時的抗原量為 10 ～1 000 μg·mL－1(Rǜdiger，2001);通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測ApNPV的最適包被濃度為 1.0 μg·mL－1，以此作為測定

何麗華等(2003)用家蠶核型多角體病毒為抗原給蛋雞注射后，獲得卵黃抗體的效價為1∶160。本研究測得的最高卵黃抗體效價為1∶210。與家蠶NPV卵黃抗體的效價差異可能是因為兩者為不同物種，并且檢測效價的方案不同。死籠率、結(jié)繭率、繭層率被用來判斷家蠶品種的生命力(司馬楊虎等，2007;冉瑞法，2012)，在安全性試驗中通過檢測死籠率、結(jié)繭率和繭層率來確定抗ApNPV IgY對柞蠶的正常發(fā)育是否有影響，用稀釋50倍的免疫卵黃與正常食物作為對照飼喂柞蠶，兩組間差異無統(tǒng)計學意義，說明抗ApNPV IgY安全可用。此外，IgY的稀釋倍數(shù)(閔嗣璠等，2007;任春芝，2011;趙鵬等，2014)和對動物的飼喂方式(何麗華等，2003;李厚偉等，2018)是影響卵黃抗體作用效果的關(guān)鍵因素。因此本研究在柞蠶飼喂試驗中，檢測了不同稀釋倍數(shù)的IgY和添食IgY的方式，以此探索Ap-NPV IgY對柞蠶膿病的防治效果。本研究制備的抗ApNPV IgY在選擇正確稀釋倍數(shù)和飼喂方式下可以有效預防柞蠶膿病及存在治療效果，為Ap-NPV的綜合防治提供了一種有效的預防手段和參考。效價的濃度，測得的最高卵黃抗體效價為1∶210;效價從第4周開始明顯上升，第6周達到最高且持續(xù)3周，第8周結(jié)束后開始下降，因此可以選取第6、7、8周的雞蛋大量提取卵黃進行安全性試驗和制備復合飼料;安全性試驗中免疫卵黃組和對照組的死籠率、繭層率和結(jié)繭率之間的差異均無統(tǒng)計學意義，說明抗ApNPV IgY安全可用;在柞蠶飼喂試驗中，測定了6～8周最高效價的卵黃抗體最佳稀釋倍數(shù)為64倍，此時柞蠶膿病發(fā)病率最低(1.67%)，說明抗ApNPV IgY能夠顯著降低柞蠶膿病的發(fā)病率;此外，首先飼喂抗體-病毒混合的 A'、B'、C'組的發(fā)病率均極顯著降低，D'組發(fā)病率顯著高于前3組，但也顯著低于攻毒對照組，說明IgY對柞蠶膿病有顯著的預防作用和治療效果。預防和治療效果相比，采取預防手段飼喂柞蠶可以更有效地阻斷柞蠶膿病的發(fā)生。