周 晗,楊曉笙,廖陳龍,張文川
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科,上海 200011
2019 年,約有4.63 億成年人患糖尿?。╠iabetes mellitus,DM),這一數(shù)字在2045 年預(yù)計(jì)將超過(guò)7 億[1]。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulceration,DFU)是最常見(jiàn)且醫(yī)療負(fù)擔(dān)最高的DM 并發(fā)癥之一,DFU 患者約占DM 患者的15%[2]。隨著DM 患病人數(shù)的增加和DM 患者預(yù)期壽命的延長(zhǎng),DFU 患者的數(shù)量將持續(xù)增加[3]。DFU 患者面臨復(fù)發(fā)和截肢的高風(fēng)險(xiǎn),并承受著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。DFU 的病因復(fù)雜多樣[4],周?chē)窠?jīng)病變、周?chē)鷦?dòng)脈疾病和重復(fù)性創(chuàng)傷被認(rèn)為是主要誘發(fā)因素。與正常傷口愈合相比,DM患者傷口愈合過(guò)程中受到高血糖、慢性炎癥、缺氧和神經(jīng)肽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損的影響[4],造成傷口愈合不良,最終可能導(dǎo)致慢性開(kāi)放性潰瘍[5]。此外,DM 患者的免疫反應(yīng)和對(duì)感染的抵抗力也發(fā)生了改變[6]。因此,有必要了解DFU發(fā)生過(guò)程中的潛在分子機(jī)制,并確定更具體有效的治療干預(yù)措施。
近年來(lái),DFU 的分子生物學(xué)機(jī)制研究已取得一些成果。Nguyen 等[7]研究發(fā)現(xiàn)活性基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)上調(diào)是DM 小鼠傷口難以愈合的原因,并證明其抑制劑(R)-ND-336 較貝卡普勒明(becaplermin,一種現(xiàn)有的經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的DFU 藥物)對(duì)傷口愈合更有效。Sunkari 等[8]提出,缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)的激活有助于改善DM 小鼠的傷口愈合。Icli 等[9]指出,miRNA-26a 可以顯著提高DM 小鼠傷口愈合的速度。Ramirez等[10]利用基因表達(dá)譜芯片研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的DFU 中miR-15b-5p 上調(diào),并在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其對(duì)DNA 修復(fù)和炎癥反應(yīng)的抑制作用。
在本研究中,GSE80178 的芯片數(shù)據(jù)下載于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI) 基 因 表 達(dá) 綜 合 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)。通過(guò)這些數(shù)據(jù)來(lái)鑒定DFU與糖尿病足皮膚(diabetic foot skin,DFS)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEG)及其生物學(xué)功能,并基于反卷積算法(CIBERSORTx)[11]探索影響DFU 發(fā)展的免疫細(xì)胞,旨在為DFU 靶向治療藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路。
mRNA 數(shù)據(jù)集GSE80178 下載自GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。 該 數(shù) 據(jù) 集 的 建 立 基 于GPL16686(Affymetrix Human Gene)平臺(tái)[10],共包含12 個(gè)獨(dú)立樣本,包括6 個(gè)DFU 樣本、3 個(gè)DFS 樣本和3 個(gè)非糖尿病足部皮膚(non-diabetic foot skin,nDFS)樣本,即正常人皮膚樣本。通過(guò)R 語(yǔ)言中的oligo 軟件包[12]讀取CEL文件探針級(jí)數(shù)據(jù)。原始表達(dá)數(shù)據(jù)使用RMA(Robust Multi-Array Average)算法[13]進(jìn)行背景校正,log2轉(zhuǎn)換及歸一化。
利用R 語(yǔ)言中的limma 包來(lái)鑒別DEG,且以P < 0.05、log2|Fold Change|(log2|FC|) >1 用作截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)。為探索DEG 涉及的基因功能,我們將DEG 提交給DAVID(Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行注釋與聚類(lèi)[14-15]?;蚬δ艿目梢暬鞘褂肎Oplot 程序包[16]生成的。對(duì)應(yīng)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05,基因計(jì)數(shù)>5。
CIBERSORTx 提供了一種反卷積算法,可根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)估算混合細(xì)胞群中成員細(xì)胞類(lèi)型的豐度。利用該算法及其提供的22 種免疫細(xì)胞的547 個(gè)標(biāo)記基因,對(duì)12 個(gè)樣本進(jìn)行反卷積分析,推斷22 種免疫細(xì)胞在nDFS、DFS 及DFU 的相對(duì)含量,并通過(guò)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析了nDFS、DFS 與DFU 之間各種免疫細(xì)胞比例的差異。使用R 語(yǔ)言的vioplot 軟件包繪制小提琴圖以可視化22 種浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的比例差異。
經(jīng)RMA 算法預(yù)處理后,所有樣品的基因表達(dá)平均值處于同一水平,以P<0.05 和log2|FC|>2 為標(biāo)準(zhǔn),共獲得296 個(gè)DFU 與DFS 之間的DEG。火山圖中顯示了80 個(gè)上調(diào)基因和216 個(gè)下調(diào)基因(圖1A)。按log2|FC| 排序,并在熱圖中展示前5 個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因(圖1B),這10個(gè)基因的具體信息見(jiàn)表1。
圖1 DFU 和DFS 之間的DEGFig 1 DEGs between DFU and DFS
表1 DFU 和DFS 之間上調(diào)和下調(diào)的前5 位DEGTab 1 Top 5 up-regulated and down-regulated DEGs between DFU and DFS
以基因本體論(Gene Ontology,GO)注釋了DFU 和DFS 之間DEG 所代表的生物學(xué)特征(表2)。以P<0.05、基因計(jì)數(shù)>5 為篩選條件,篩選出3 個(gè)下調(diào)和11 個(gè)上調(diào)的生物過(guò)程,以及5 個(gè)下調(diào)和3 個(gè)上調(diào)的細(xì)胞成分。角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)、表皮發(fā)育、中性粒細(xì)胞趨化性等生物過(guò)程在DFU 組上調(diào),下調(diào)的生物過(guò)程包括來(lái)自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細(xì)胞黏附。在細(xì)胞成分類(lèi)別中,DEG 主要集中在外泌體和細(xì)胞外空間。
表2 GO 分析DEG 的生物過(guò)程與細(xì)胞成分Tab 2 Biological process and cellular component of DEGs
通 過(guò)CIBERSORTx 算 法,從6 個(gè)DFU 樣 品 和3 個(gè)DFS 樣品中獲得22 種免疫細(xì)胞的比例。與DFS 相比,DFU 中CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)和活化的肥大細(xì)胞比例增加,而靜息肥大細(xì)胞和活化的NK 細(xì)胞的比例降低(圖2)。
圖2 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細(xì)胞的相對(duì)比例Fig 2 Relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS
圖3 DFU、DFS 和nDFS 中免疫細(xì)胞相對(duì)比例的比較Fig 3 Comparation of the relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS
為進(jìn)一步驗(yàn)證在DFU 發(fā)生前后各免疫細(xì)胞比例差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分別對(duì)nDFS 與DFS 組、DFS 與DFU 進(jìn)行比較。如圖3 所示,nDFS 與DFS 組間,未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的免疫細(xì)胞(均P >0.05);DFS 組與DFU 組間,DFU 中CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞和靜息NK 細(xì)胞比例顯著升高,而活化的NK 細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞比例顯著降 低。
DFU 是DM 的常見(jiàn)并發(fā)癥,每年影響全球2 610 萬(wàn)人[2]。DFU 的復(fù)發(fā)及因其導(dǎo)致的截肢是該疾病的主要難題。年復(fù)發(fā)率估計(jì)為22.1%[17],截肢的年發(fā)生率為0.25%~1.80%,截肢后1 年的死亡率為44%[18-19]。盡管最近研究人員對(duì)DFU 發(fā)病機(jī)制展開(kāi)了一些研究,但是目前對(duì)其的了解仍相對(duì)有限,因此有必要對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行 更深入的了解以尋找潛在的治療靶點(diǎn),提供更多的治療選擇。
本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了DFU 和DFS 的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集??偣茶b定出80 個(gè)上調(diào)基因和216 個(gè)下調(diào)基因,用于后續(xù)的GO 功能富集。在前5 個(gè)上調(diào)的基因中,S100A12 參與先天免疫應(yīng)答的抗微生物感染,發(fā)揮細(xì)胞因子和趨化因子的作用,并可募集大量白細(xì)胞[20];MMP-1 在傷口愈合過(guò)程所涉及的細(xì)胞遷移、上皮化和組織修復(fù)中起重要作用[21-22];SPRR2B 和SPRR2F 編碼的蛋白質(zhì)是角質(zhì)化包膜的組成部分,是對(duì)抗細(xì)胞外和環(huán)境因素的屏障[23]。由此推測(cè),DFU 組織中先天免疫應(yīng)答、抗菌功能以及特定的角質(zhì)形成有所增強(qiáng)。在前5 個(gè)下調(diào)的基因中,KRT2、DCD 和FLG2 或可作為潛在的治療靶點(diǎn)。KRT2 編碼在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的上棘層中表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白,KRT2 缺乏會(huì)導(dǎo)致角化過(guò)度,并引起局部炎癥[24-25]。DCD 編碼的C 端肽具有抗菌和抗真菌活性[26]。FLG2 蛋白可以為皮膚提供物理屏障,并且該蛋白的C 端片段具有抗菌作用。推測(cè)DCD 和FLG2 的顯著下調(diào)可能與DFU 復(fù)發(fā)有關(guān)。其他3個(gè)基因HEPHL-1、TYRP1 和PIP 在DFU 中的作用有待進(jìn)一步的研究。
GO 分析用于了解這些DEG 編碼蛋白可能涉及的生物過(guò)程和細(xì)胞成分?;捉琴|(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移是皮膚潰瘍恢復(fù)的關(guān)鍵因素[27]。在DFU 樣品,角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、角質(zhì)化、肽交聯(lián)和表皮發(fā)育表現(xiàn)活躍。角質(zhì)形成細(xì)胞不僅提供物理屏障來(lái)預(yù)防細(xì)菌感染,而且還通過(guò)產(chǎn)生抗菌肽、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)促進(jìn)早期免疫反應(yīng)[28]。此外,與免疫相關(guān)的過(guò)程,例如中性粒細(xì)胞趨化性和對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)也有所增強(qiáng)。其他上調(diào)的生物過(guò)程包括血管生成的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的正調(diào)控和細(xì)胞增殖的正調(diào)控。由這些上調(diào)的生物過(guò)程推測(cè),DFU 局部皮膚正在進(jìn)行主動(dòng)表皮和血管修復(fù)和主動(dòng)的炎癥反應(yīng),以及增強(qiáng)抗菌功能。下調(diào)的生物過(guò)程包括來(lái)自于RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、軸突導(dǎo)向和細(xì)胞黏附。在細(xì)胞成分類(lèi)別中DEG 主要集中在外泌體和細(xì)胞外空間,因此DFU 中的細(xì)胞外微環(huán)境和細(xì)胞之間的信息傳遞值得研究者關(guān)注。
根據(jù)上述研究結(jié)果推測(cè),DFU 的形成可能伴隨著免疫微環(huán)境的改變。因此,本研究應(yīng)用CIBERSORTx 對(duì)DFU 發(fā)生前后各種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例進(jìn)行了全面評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在DFS 和nDFS 中各免疫細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與先前的研究[29]結(jié)果一致。因此,推測(cè)DM 患者皮膚對(duì)潰瘍的敏感性可能不是由于局部免疫微環(huán)境的改變,即在潰瘍發(fā)生前DM 患者皮膚局部免疫微環(huán)境改變并不明顯。而在DFU 和DFS 的對(duì)比中我們發(fā)現(xiàn),活化的肥大細(xì)胞、靜息NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞比例增加。
肥大細(xì)胞參與傷口愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)重吸收[30]。DFU 組中活化的肥大細(xì)胞比例顯著增加,而靜息肥大細(xì)胞比例顯著下降。該差異反映了DFU 中肥大細(xì)胞可能被激活,脫顆粒;而最近的研究表明,這種現(xiàn)象不利于傷口愈合。Tellechea 等[31]報(bào)道了在損傷之前或之后,局部應(yīng)用肥大細(xì)胞脫顆粒抑制劑MCS- 01 可以加速DM 小鼠的傷口愈合;在另一項(xiàng)研究[32]中,用肥大細(xì)胞脫顆粒抑制劑色甘酸二鈉預(yù)處理可以修復(fù)DM 小鼠的傷口愈合損傷。在一項(xiàng)應(yīng)用光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基治療DM 大鼠傷口的研究中,Bagheri 等[33]發(fā)現(xiàn)光生物調(diào)節(jié)和條件培養(yǎng)基加速了傷口愈合過(guò)程,并顯著減少了肥大細(xì)胞總數(shù)和肥大細(xì)胞脫顆粒。
單核細(xì)胞進(jìn)入棘層分化為朗格漢斯細(xì)胞[34]。DFU 中此類(lèi)細(xì)胞比例顯著增加,這與Stojadinovic 等[35]的研究一致;他們還報(bào)道了朗格漢斯細(xì)胞的數(shù)量在DFU 愈合后增 加,表明朗格漢斯細(xì)胞對(duì)潰瘍修復(fù)具有理論上的積極作 用。
NK 細(xì)胞的主要功能是識(shí)別病毒感染細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合物,觸發(fā)細(xì)胞因子釋放并引起細(xì)胞裂解或凋亡[36]。CD8+T 細(xì)胞具有與NK 細(xì)胞類(lèi)似的細(xì)胞殺傷功能[37]。本研究發(fā)現(xiàn)DFU 中活化的NK 細(xì)胞減少,CD8+T細(xì)胞的比例增加,反映局部細(xì)胞免疫可能參與了DFU 的病理過(guò)程,但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
既往針對(duì)數(shù)據(jù)集GSE80178 的研究發(fā)現(xiàn)了miR-15b-5p 在DFU 中的作用[10],以及DFS 與nDFS 間的差異[29]。與之不同,本研究旨在探究DFU 發(fā)病過(guò)程中分子和免疫細(xì)胞的變化。從該數(shù)據(jù)集中本研究共篩選出296 個(gè)DEG,用于功能富集和浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分析,并發(fā)現(xiàn)了可能成為DFU 治療靶點(diǎn)的基因和免疫細(xì)胞。DFU 發(fā)展中的主要生物過(guò)程包括角質(zhì)化、先天免疫和抗菌功能。此外,高血糖對(duì)皮膚局部的免疫細(xì)胞比例影響較小,提示潰瘍的發(fā)生可能與其他因素如神經(jīng)或血管因素有關(guān)。在潰瘍發(fā)生后,活化的肥大細(xì)胞、靜息NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞比例增加,提示它們與潰瘍的形成或修復(fù)存在關(guān)聯(lián)??紤]到本研究局限于單個(gè)數(shù)據(jù)集,樣本數(shù)量較少且缺少臨床樣本驗(yàn)證,未來(lái)還需要進(jìn)一步開(kāi)展更為深入的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本研究的結(jié)果。
參·考·文·獻(xiàn)
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上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2020年10期