梁智豪，陳智謙，陳 辰，周益帆，楊 驍，趙 杰

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海市骨科內(nèi)植物重點實驗室，上海 200011

椎間盤退行性變（intervertebral disc degeneration, IDD）是導(dǎo)致慢性下腰痛的主要病因之一[1]，給我國公共衛(wèi)生事業(yè)帶來沉重的經(jīng)濟負擔[2]。雖然目前IDD 的發(fā)生機制并未完全闡明，但普遍認為IDD 與椎間盤（intervertebral disc, IVD）內(nèi)環(huán)境炎癥狀態(tài)的改變密切相關(guān)[3-4]。通過抑制炎癥通路延緩IDD 進展，已成為近年來的研究熱點。

人參皂苷Re 是人參皂苷的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化及抗癌等多種功效[5-7]。人參皂苷Re 通過抑制Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase, JNK）及核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）等炎癥通路發(fā)揮作用[8]，在治療心肌纖維化、心力衰竭[9]、腎功能衰竭[10]、酒精性肝損傷[11]等多種疾病中被證實有效。此外，研究[12]顯示，人參皂苷在抑制關(guān)節(jié)軟骨的降解中具有明顯的效果，可能具有治療軟組織炎癥的功效。

在本研究中，我們探究了人參皂苷Re 是否可以延緩IDD 進展及其是否具有治療作用，通過可引起IVD 退變的炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的刺激，利用體外髓核（nucleus pulposus, NP）細胞和體內(nèi)大鼠尾椎針刺模型共同探究人參皂苷Re 的潛在作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 NP 細胞

大鼠NP 細胞由美國Rush 大學醫(yī)學中心骨科陳棣教授贈送。細胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)(Gibco, Thermo Fisher Scientific, 美國)。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測NP 細胞炎癥及代謝相關(guān)基因的表達

將NP 細胞以1×105/孔的密度種植在6 孔板24 h，按照12.5、25 和50 μmol/L 濃度加入人參皂苷Re，2 h 后加入10 ng/mL TNF-α；對照細胞只加入TNF-α。24 h 后，按照說明書使用TRIzol 試劑（Thermo Fisher Scientific, 美國）從NP 細胞中提取RNA。使用cDNA 合成試劑盒（Takara Bio, 日本)從提取的RNA 中反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈互補DNA (cDNAs)。使用GoTaq 1-step RT-qPCR 系統(tǒng)（Promega, 美國）和瓊脂糖凝膠電泳（Bio-Rad Laboratory, 美國）測定基因基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3, Mmp 3）、血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5, Adamts 5）、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原a1（collagen type Ⅱ a1, Col2a1）的mRNA 相對表達量。在Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex 實時PCR 系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific, 美國）中使用TB Green Premix Ex Taq 試劑盒（Takara Bio, 日本）進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）。目標基因的表達水平通過2－ΔΔCt方法測定，利用Gapdh 循環(huán)次數(shù)（cycle time, Ct）校準實驗組目標基因。qPCR 引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB 通路相關(guān)蛋白的表達

將NP 細胞以1×105/孔的密度種植在6 孔板24 h后，加入人參皂苷Re（50 μmol/L）2 h 后加入TNF-α（10 ng/mL）；以僅加入TNF-α 的NP 細胞為陽性對照，空白對照細胞不作處理。TNF-α 刺激10 min 后使用添加了蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀法緩沖液（RIPA）提取細胞總蛋白（Roche, 瑞士）。使用10%或12.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠等量溶解提取好的蛋白（20～30 μg），將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至0.22 μm 聚偏二氟乙烯膜上。膜使用含5%牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽溶液（BSA-PBS）在室溫下封閉1 h，然后與一抗（在5% BSA-PBS 中以1:1 000 稀釋）在4 ℃孵育過夜（至少16 h）。p-IKKα (Ser176/180)、IKKα (D3W6N)、p-NFκB p65 (Ser536)、NF-κB p65 (D14E12)、p-IκBα (Ser32)、IκBα (44D4) 及β-actin (13E5) 抗 體 均 購 于Cell Signaling Technology（ 美 國）。 使 用Tris-buffered saline-Tween20 (TBST)洗膜，然后使用二抗室溫黑暗環(huán)境下孵育1 h。再次采用TBST 洗膜，并使用LI-COR Odyssey 熒光成像系統(tǒng)（美國）檢測蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)性。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對蛋白免疫反應(yīng)條帶強度進行半定量分析，并利用內(nèi)參β-actin 進行校準。

1.4 動物手術(shù)過程及影像學觀察

所有動物實驗均經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（審批號SH9H-2020-TK265-1）。12 只8 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠，購于上海甲干生物科技有限公司。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2015-0005，動物使用許可證號為SYXK（滬）2013-0087。在26 ～28 ℃、50% ～65% 濕度、12 h 晝夜循環(huán)的無病原體條件下飼養(yǎng)。動物以標準嚙齒動物食物飼養(yǎng)并可獲得淡水。手術(shù)前，通過腹腔注射苯巴比妥鈉（5 mg/100 g）麻醉大鼠。12 只大鼠尾部用碘化聚乙烯吡咯烷酮消毒，然后做背側(cè)縱向皮膚切口，顯露尾椎（Co）6 ～8 的IVD。Co6/7 的IVD 作為假手術(shù)對照節(jié)段，不進行針刺；Co7/8 作為針刺節(jié)段，用20 號無菌針垂直于皮膚刺穿IVD 并旋轉(zhuǎn)退出，縫合切口。其中，6 只大鼠作為實驗組，每周腹腔注射50 μmol/L 人參皂苷Re 3 次，每次100 μL；其余6 只大鼠作為對照組，每周腹腔注射等量PBS。1 個月后行X 線檢查，使用21 lp/mm 探測器在前后徑上對針刺后的IVD 進行數(shù)字X 線成像（Faxitron VersaVision, Faxitron Bioptics LLC, 美國），以上下終板連線為IVD 高度指數(shù)進行退變分析。

1.5 免疫熒光染色

1.5.1 檢測NP 細胞NF-κB p65 磷酸化情況 將NP 細胞玻片使用PBS 浸洗3 次，每次3 min；使用4%多聚甲醛溶液固定15 min；再次使用PBS 浸洗3 次，每次3 min；在室溫下使用封閉緩沖液封閉30 min。切片與一抗在4 ℃的濕箱中孵育過夜；一抗p-NF-κB p65 (Ser536)、DAPI（40835）購于Cell Signaling Technology 公司（美國），按照1:1 000稀釋。第2 日，用PBS 洗滌玻片，然后與1:500 稀釋的Alexa Fluor 594 兔二抗（Cell Signaling Technology, 美國）在室溫黑暗環(huán)境中孵育50 min。最后用PBS 洗滌玻片、風干，并使用熒光淬滅片封閉。在Leica DM4000B 熒光顯微鏡（Leica Microsystems, 德國)下捕獲數(shù)字熒光圖像，并使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行積分光密度（integrated option density, IOD）測量。

1.5.2 檢測尾椎組織TNF-α、MMP 3、聚集蛋白聚糖及COL2A1 蛋白的表達 處死所有大鼠，取出尾部，清理軟組織，并將尾椎使用4%多聚甲醛溶液固定。組織切片在二甲苯中脫蠟、乙醇溶液中復(fù)水，然后在37 ℃的抗原修復(fù)緩沖液（Roche, 瑞士）中孵育30 min。冷卻至室溫后，將切片浸泡于pH 值7.4 的PBS 中，洗滌3 次，每次5 min。加入自動熒光淬滅劑5 min，然后在室溫下使用封閉緩沖液封閉30 min。切片與一抗在4 ℃的濕箱中孵育過夜。一抗p-NF-κB p65 (Ser536)、DAPI (40835)、TNF-α (D2D4)、MMP 3 (D7F5B) 購 于Cell Signaling Technology公司（美國），聚集蛋白聚糖（EPR14664）及COL2A1（EPR12268）購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，均按照1:1 000 稀釋。第2 日，用PBS 洗滌切片，然后與1:500稀釋的Alexa Fluor 594 兔二抗（Cell Signaling Technology，美國）在室溫黑暗環(huán)境中孵育50 min。最后用PBS 洗滌切片、風干，并使用熒光淬滅片封閉。在Leica DM4000B熒光顯微鏡（Leica Microsystems, 德國)下捕獲數(shù)字熒光圖像，并使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行IOD 測量。

1.6 番紅固綠及蘇木精-伊紅染色觀察IVD 形態(tài)變化及組織學評估

將固定好的IVD 組織標本（5 μm 厚）包埋于石蠟切片內(nèi)。組織切片在二甲苯中脫蠟、乙醇溶液中復(fù)水，然后在37 ℃的抗原修復(fù)緩沖液（Roche）中孵育30 min。冷卻至室溫后，將切片浸泡于pH 值7.4 的PBS 中，洗滌3次，每次5 min。將切片分別進行番紅固綠及蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, H-E）染色。在Olympus TH4-200顯微鏡（Olympus, 日本）下使用Olympus DP Controller 捕獲數(shù)字圖像。參考相關(guān)文獻[13]，通過評估數(shù)字圖像纖維環(huán)形態(tài)、纖維環(huán)和NP 之間的交界處形態(tài)、NP 細胞密度及正中矢狀面基質(zhì)狀態(tài)，對IDD 進行組織學分級（每項1 ～3 分，總分為4 ～12 分，4 分為健康，12 分為嚴重退變）。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均進行3 次獨立實驗或重復(fù)測量，數(shù)據(jù)以x±s 表示。符合正態(tài)分布的2 組間定量比較采用成組t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Re 體外對NP 細胞炎癥因子的作用

TNF-α 刺激24 h 后，NP 細胞炎癥相關(guān)基因Mmp 3 和Adamts 5 表達上升（P=0.000），而軟骨相關(guān)基因聚集蛋白聚糖和Col2a1 的表達則下降（P=0.000）。經(jīng)50 μmol/L 人參皂苷Re 作用后，與單用TNF-α 的細胞比較，Mmp 3 和Adamts 5 表達明顯下降，聚集蛋白聚糖、Col2a1 表達明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），且此作用具有濃度依賴性（圖1）。

圖1 人參皂苷Re 對Mmp 3、Adamts 5、聚集蛋白聚糖、Col2a1 基因表達的影響Fig 1 Effect of ginsenoside Re on gene expressions of Mmp 3, Adamts 5, aggrecan and Col2a1

2.2 人參皂苷Re 對NF-κB 通路的抑制作用

蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果（圖2A、C）顯示：在TNF-α刺激10 min 后，NP 細胞NF-κB 通路上游高相對分子質(zhì)量IκB 激酶 IKK 復(fù)合體磷酸化，p-IKKα 蛋白表達升高；p-IκBα 蛋白和p-p65 蛋白表達顯著升高（均P=0.000）；加入50 μmol/L 人 參 皂 苷Re 后，p-IκBα 蛋 白 和p-p65 蛋 白與單純使用TNF-α 刺激的NP 細胞比較，表達量顯著降低（均P=0.000）。免疫熒光實驗結(jié)果顯示：TNF-α 刺激可以促進p65 蛋白磷酸化而人參皂苷Re 則可以抑制這個過程（圖2B、D）。

圖2 人參皂苷Re 對NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達的影響Fig 2 Effect of ginsenoside Re on expressions of NF-κB pathway-related proteins

2.3 人參皂苷Re 對大鼠IDD 程度的影響

術(shù)后1 個月X 線片檢測結(jié)果顯示，對照組（腹腔注射PBS）Co7/8 針刺節(jié)段與Co6/7 假手術(shù)節(jié)段相比，椎間隙骨贅增生明顯，椎間隙塌陷；相反，實驗組（腹腔注射50 μmol/L 人參皂苷Re）的大鼠尾椎間隙僅表現(xiàn)為輕度的骨贅增生，且具有良好的高度（圖3A）。統(tǒng)計分析結(jié)果（圖3B）顯示：與相應(yīng)的假手術(shù)節(jié)段相比，實驗組和對照組的針刺節(jié)段椎間隙高度均減?。≒=0.034，P=0.032）；但實驗組針刺節(jié)段椎間隙高度大于對照組（P=0.004）。H-E 染色及番紅固綠染色結(jié)果（圖3C、D）顯示：對照組大鼠針刺節(jié)段IVD 相較于假手術(shù)節(jié)段退變嚴重，NP 水分丟失皺縮；而實驗組針刺節(jié)段IVD 相較于假手術(shù)節(jié)段則退變較輕，NP 水分丟失較少，皺縮不明顯。與對照組針刺節(jié)段相比，實驗組針刺節(jié)段的退變程度明顯改善，組織學分級的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023，圖3E）。

2.4 人參皂苷Re 對大鼠IVD 細胞外基質(zhì)的影響

免疫熒光定量分析結(jié)果（圖4）顯示：在對照組中，與假手術(shù)節(jié)段相比，針刺節(jié)段的大鼠尾椎IVD 內(nèi)COL2A1及聚集蛋白聚糖含量明顯降低，而MMP 3 及TNF-α 的含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P=0.000）。同為針刺節(jié)段時，與對照組相比，實驗組的大鼠尾椎IVD 內(nèi)炎癥相關(guān)蛋白MMP 3 及TNF-α 含量較低，而COL2A1及聚集蛋白聚糖含量較高，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P=0.000）。

3 討論

圖3 人參皂苷Re 對大鼠IDD 的改善作用Fig 3 Improvement effect of ginsenoside Re on IDD of rats

IVD 位于脊柱椎體的中間，主要由中心富含蛋白多糖呈凝膠狀的NP 組織，以及外周富含膠原的纖維軟骨組織的纖維環(huán)組成[14-15]。IDD 是一個復(fù)雜的生理過程。機械應(yīng)力因素、遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化以及IVD 炎癥因子如TNF-α[16]等在NP 組織中的浸潤等多種原因都會導(dǎo)致IDD 的產(chǎn)生和加重。這些因素導(dǎo)致IDD 的主要原因是破壞了IVD 中NP 細胞的細胞外基質(zhì)的代謝平衡，使得分解代謝增加而合成代謝減弱。分解代謝的增加會導(dǎo)致NP細胞的MMP 和ADAMTS 表達增加，從而加速了細胞外基質(zhì)的降解[17]。合成代謝的減弱會導(dǎo)致NP 細胞細胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的減少。降解的細胞外基質(zhì)無法維持IVD 的含水量以及承擔相應(yīng)的應(yīng)力負荷。這個過程同時伴有NP 組織大量的炎癥因子浸潤，而該過程起主要作用的炎癥因子是TNF-α[18-20]。過度表達的炎癥因子和細胞外基質(zhì)的失平衡互為因果、互相加重。

圖4 人參皂苷Re 對大鼠IVD 細胞外基質(zhì)的改善作用Fig 4 Improvement effect of ginsenoside Re on IVD extracellular matrix of rats

對于IDD 導(dǎo)致的腰痛，根據(jù)疾病的輕重常規(guī)采用從腰背肌鍛煉、口服止痛藥，再到微創(chuàng)或者開放手術(shù)的階梯式治療方法[21]。緩解IDD 導(dǎo)致的腰痛，最常用的藥物是非甾體類抗炎藥（如雙氯芬酸等）。這類藥物可以通過調(diào)節(jié)炎癥因子暫時起到緩解腰痛的作用，但是無法改變IDD的進展，并且會帶來許多的不良反應(yīng)[22-23]。目前，多種植物來源的化合物由于其良好的抗炎作用及相對小的不良反應(yīng)而受到了越來越多的關(guān)注。人參皂苷Re 主要存在于人參屬藥材當中，是一種固醇類化合物，作為人參皂苷的主要活性成分，其抗炎和抗氧化等功效已在多種疾病中得到了證實[9,24-26]。在本研究中，我們探究了人參皂苷Re 在IDD 過程中所起的保護作用及其機制。在炎癥反應(yīng)中，由NF-κB 信號通路產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α 等，加劇了細胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖等蛋白的降解，促進了MMP 和ADAMTS 等分解代謝蛋白的合成，對IDD起著重要的作用[27]。而TNF-α 與NP 細胞的TNF 受體結(jié)合，促進了NF-κB 信號通路進一步激活，形成了炎癥反應(yīng)正反饋環(huán)路，加劇了IVD 中的炎癥反應(yīng)。本研究以IDD 中的炎癥因子TNF-α 為核心，探究了人參皂苷Re 在IDD 中的作用。

本研究通過探究不同濃度人參皂苷Re 對NP 細胞增殖的影響，確定了合適的刺激濃度。既往文獻[28-29]報道，在TNF-α 激活NF-κB 后，引起IKKα 磷酸化，使IκBα 激酶被激活，進而導(dǎo)致IκBα 磷酸化，最后IκBα 蛋白被降解，隨后NF-κB 從IκBα 復(fù)合體中分離出來，NF-κB p65亞單位磷酸化后從細胞質(zhì)進入細胞核，調(diào)控下游炎癥因子的合成。本研究中的蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示人參皂苷Re 抑制了由炎癥因子TNF-α 引起的NP 細胞的IKKα、IκBα、p65 的磷酸化，抑制了由TNF-α 引起的IκBα 的降解；免疫熒光結(jié)果表明人參皂苷Re 抑制了由TNF-α 引起的NP 細胞p65 的核轉(zhuǎn)位。這表明人參皂苷Re 對NF-κB信號具有較好的抑制作用。既往許多研究表明，MMP 和ADAMTS 破壞了IDD 患者細胞外基質(zhì)合成代謝和分解代謝之間的平衡。本研究中，IVD 組織番紅固綠染色結(jié)果顯示人參皂苷Re 對細胞外基質(zhì)具有保護作用，免疫熒光檢測結(jié)果顯示COL2A1、聚集蛋白聚糖表達降低而MMP 3 表達升高；說明人參皂苷Re 可以部分逆轉(zhuǎn)由TNF-α 刺激導(dǎo)致的分解代謝的增加以及合成代謝的減弱，使得細胞外基質(zhì)得到較好的保護。結(jié)合以上結(jié)果，說明人參皂苷Re 有效地抑制了IDD 的發(fā)展過程。

綜上，本實驗結(jié)果表明人參皂苷Re 可以通過抑制NF-κB 信號通路，抑制相關(guān)炎癥因子的表達，改善細胞外基質(zhì)的合成、分解代謝的失平衡，從而延緩IDD 的進程。人參皂苷Re 在NP 細胞中的抗炎作用表明其可以作為IDD 治療的潛在藥物。

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