王歡歡，白 林，黃曉舞（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853）

兒童開胃樂是解放軍總醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑品種，臨床使用已經(jīng)超過20余年，質(zhì)量可靠，療效安全。處方由山楂、雞內(nèi)金、麥芽、萊菔子等七味中藥組成，適用于喂養(yǎng)不當(dāng)引起的厭食，感冒引起的食欲不振等，服用后胃口好、體質(zhì)壯、血色素提高。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較低，沒有含量測(cè)定項(xiàng)，為了更好的控制其內(nèi)在質(zhì)量，本研究采用HPLC法對(duì)兒童開胃樂中芥子堿硫氰酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，旨在更好地控制其質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JA2003型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；MS205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）；LC-2030C3D高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

兒童開胃樂（解放軍總醫(yī)院，批號(hào)：190701、190702、190703；規(guī)格：10 mL/支）；芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品（北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)：B0002909，純度：93.1%）；萊菔子對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121074 - 201304）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為一級(jí)水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[1]

色譜柱：苯基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司）；流動(dòng)相：乙腈-3%冰醋酸水溶液（12∶88）為流動(dòng)相；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為326 nm；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按芥子堿硫氰酸鹽峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，混勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取混合均勻的供試品2 g，置于50 mL容量瓶中，加70%甲醇30 mL，混勻，超聲30 min，取出冷卻至室溫，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，8000 r·min-1離心5 min，取上清液，0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，備用。

2.2.3 萊菔子對(duì)照藥材溶液 取萊菔子對(duì)照藥材細(xì)粉約0.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成萊菔子對(duì)照藥材溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 取缺少萊菔子藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、萊菔子對(duì)照藥材溶液及陰性樣品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果顯示，供試品中芥子堿硫氰酸鹽與對(duì)照品及對(duì)照藥材在相同保留時(shí)間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A - 芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品，B - 萊菔子藥材，C - 供試品，D - 陰性對(duì)照；1 - 芥子堿硫氰酸鹽Fig 1 HPLC chromatogramsA - sinapine thiocyanate reference substance, B - semen raphani, C -test sample, D - negative control; 1 - sinapine thiocyanate

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品23.72 mg置20 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.10 mg·mL-1，作為貯備液。取貯備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為中間液。分別精密量取中間液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成芥子堿硫氰酸鹽濃度分別為0.55、1.10、2.21、5.52、11.04、22.08、44.16 μg·mL-1的對(duì)照品系列溶液。將上述對(duì)照品系列溶液分別進(jìn)樣10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄峰面積。以濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芥子堿硫氰酸鹽回歸方程：Y= 32 242X- 9 679.1，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 9。結(jié)果表明，芥子堿硫氰酸鹽在0.55 ～ 44.16 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，芥子堿硫氰酸鹽峰面積的RSD為2.30%（n= 5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取批號(hào)為190701的供試品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，平行制備6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果顯示，芥子堿硫氰酸鹽含量為0.033 7%，RSD = 0.30%（n= 6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 方法檢測(cè)限與定量限

精密吸取“2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加甲醇逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣，記錄色譜圖，在信噪比為3∶1時(shí)，測(cè)得檢測(cè)限為0.99 μg·g-1，在信噪比為10∶1時(shí)，測(cè)得定量限為2.76 μg·g-1。

2.8 回收率試驗(yàn)

稱取混合均勻的供試品2 g（批號(hào)：190701）于50 mL容量瓶，分別精密加入對(duì)照品貯備液（1.104 mg·mL-1）490、630、730 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理供試品，分別制備成低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)供試品溶液，加標(biāo)量分別為540.96、695.52、805.92 μg。每個(gè)水平制備3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，平均回收率為106.08%（RSD=0.71%，n= 9），結(jié)果見表1。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將制備好的供試品溶液和對(duì)照品溶液，在室溫放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h后分別上機(jī)測(cè)定芥子堿硫氰酸鹽，供試品溶液和對(duì)照品溶液中芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD分別為0.50%和1.50%（n= 5），表明上述溶液在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery tests . n = 9

2.10 樣品中芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定

取三批中試樣品（批號(hào)：20190701、20190702、20190703），分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果顯示芥子堿硫氰酸鹽含量分別為0.032 8%、0.032 9%、0.033 4%。

3 討論

3.1 專屬性考察[1]

在含量測(cè)定專屬性試驗(yàn)中，分別制備了萊菔子對(duì)照藥材溶液，缺少萊菔子藥材的陰性樣品溶液及空白溶劑按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，萊菔子對(duì)照藥材溶液在與芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置有相同的色譜峰出現(xiàn)，空白溶劑及陰性對(duì)照溶液在芥子堿硫氰酸鹽峰位置處無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，不干擾本品含量測(cè)定。

3.2 提取方法和時(shí)間考察[2]

在供試品制備過程中，比較甲醇、50%甲醇、70%甲醇三種提取溶劑，結(jié)果顯示70%甲醇提取效果較好。故確定本品溶劑為70%甲醇。同時(shí)考察了不同提取時(shí)間（20 min、30 min、40 min）對(duì)含量的影響，結(jié)果顯示超聲30 min時(shí)含量高于20 min，超聲40 min與30 min時(shí)供試品中芥子堿硫氰酸鹽含量基本一致，故確定本品提取時(shí)間為30 min。

3.3 色譜條件的選擇

參照文獻(xiàn)[1,3-6]，選擇乙腈-0.08 mol·L-1KH2PO4溶液為流動(dòng)相，普通C18色譜柱，通過調(diào)整流動(dòng)相的比例，改變流速等，都未能達(dá)到理想的分離效果，對(duì)照品峰有拖尾，重現(xiàn)性不好，有時(shí)甚至不出峰。分析原因可能是芥子堿硫氰酸鹽在流動(dòng)相中溶解性不好，樣品中待測(cè)組分峰與相鄰雜質(zhì)小峰未能有效分離。以緩沖鹽為流動(dòng)相，若使用不當(dāng)會(huì)造成柱壓升高、柱效下降以及化合物保留時(shí)間變化等問題。參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）一部萊菔子藥材標(biāo)準(zhǔn)，以乙腈-3%冰醋酸水溶液（15∶85）為流動(dòng)相，采用普通C18色譜柱，通過調(diào)整流動(dòng)相比例，改變流速等也未能達(dá)到理想的分離效果，對(duì)照品峰有拖尾，樣品中待測(cè)組分峰與相鄰雜質(zhì)小峰未能有效分離，試用苯基柱后，通過調(diào)整流動(dòng)相比例，以乙腈-3%冰醋酸水溶液（12∶88）為流動(dòng)相，供試品中芥子堿硫氰酸鹽峰與相鄰雜質(zhì)峰能夠達(dá)有效分離且分離度良好。

3.4 系統(tǒng)耐用性考察

為了考察微小變動(dòng)因素對(duì)本品含量測(cè)定的影響，調(diào)節(jié)流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、柱溫（30 ℃、35 ℃）及將苯基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司）更換成另一根苯基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，菲羅門科學(xué)儀器有限公司），進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，RSD均符合要求。在測(cè)試條件有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果基本不受影響。

3.5 含量限度考察

根據(jù)上述三批含量測(cè)定數(shù)據(jù)，結(jié)合大生產(chǎn)工藝因素及不同批次間藥材含量高低差異，為確保成品質(zhì)量，暫定兒童開胃樂中芥子堿硫氰酸鹽含量不得少于0.026%。