盧軍，何承輝，阿依提拉·麥麥提江，康小龍

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 藥物研究室，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所 藥劑室，新疆 烏魯木齊 830004）

系統(tǒng)性硬皮病的病理表現(xiàn)為多組織、多器官纖維化，免疫系統(tǒng)失衡及血管異常[1]。刺山柑為白花菜科山柑屬植物，系新疆道地藥材。刺山柑果實(shí)乙醇提取物對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原的合成有一定抑制作用[2]。硬皮病模型小鼠的膠原沉積、真皮增厚等病理改變可被刺山柑流浸膏抑制[3]。給硬皮病小鼠外用刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物后，小鼠真皮增厚，Ⅰ型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1過表達(dá)被抑制[4]。刺山柑總生物堿系本課題組從刺山柑中提取的有效成分，前期研究表明，將刺山柑總生物堿制成乳膏給系統(tǒng)性硬皮病小鼠外用后，小鼠皮膚增厚、纖維化等情況有所改善[5]，同時(shí)羥脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型膠原過表達(dá)被逆轉(zhuǎn)[6-7]，提示刺山柑總生物堿可抑制系統(tǒng)性硬皮病膠原合成，改善組織纖維化。本實(shí)驗(yàn)觀察刺山柑總生物堿對(duì)Wnt 通路相關(guān)蛋白Wnt3a、Wnt1 誘導(dǎo)的信號(hào)通路蛋白1（WISP1）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的影響，研究其對(duì)系統(tǒng)性硬皮病Wnt/β-catenin 通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性BALB/c 小鼠90 只，體重18 ～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

刺山柑原藥材（新疆麥迪森維藥飲片廠），刺山柑乳膏（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥物研究室自制）鹽酸博萊霉素注射劑（批號(hào)：17001711，上海瀚暉制藥有限公司），青霉胺片（批號(hào)：052160901，上海上藥信誼藥廠）。

1.3 試劑

β-catenin 抗體、goat anti-rabbit IgG-HRP 購自美國(guó)Cell Signaling 公司，SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒、小鼠WISP1 ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，高純總RNA 快速提取試劑盒、SYBR real-time PCR 試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，小鼠Wnt3a ELISA 試劑盒購自武漢華美生物公司，蛋白測(cè)定試劑盒（BCA 法）購自江蘇碧云天生物公司。

1.4 儀器

酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiskan Spectrum）、低溫離心機(jī)（型號(hào)：Multifuge X1R）購自美國(guó)Thermo Fisher 公司，顯微鏡（型號(hào)：LEICA DFC360 FX）、切片機(jī)（型號(hào)：LEICA RM2245）購自德國(guó)Leica 公司，實(shí)時(shí)定量PCR 儀（型號(hào)：C1000 Thermal Cycler）購自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.5 方法

1.5.1 小鼠系統(tǒng)性硬皮病模型的復(fù)制及給藥方法BALB/c 小鼠90 只隨機(jī)分為6 組：空白對(duì)照組、系統(tǒng)性硬皮病模型組（SSc 模型組）、刺山柑總生物堿低劑量組（225 mg/kg）、刺山柑總生物堿中劑量組（450 mg/kg）、刺山柑總生物堿高劑量組（900 mg/kg）及青霉胺組（125 mg/kg），每組15 只。剃除小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛，除空白對(duì)照組背部皮下注射生理鹽水外，其余各組皮下注射鹽酸博萊霉素復(fù)制系統(tǒng)性硬皮病模型[8-9]：30 μg/d×30 d，然后各給藥組小鼠背部外敷刺山柑乳膏，青霉胺組小鼠給予青霉胺灌胃，1 次/d×60 d。

1.5.2 小鼠皮膚組織Wnt3a 和WISP1 濃度的檢測(cè)未次給藥4 h 后處死小鼠，取小鼠背部皮膚用組織勻漿機(jī)研磨成10%組織勻漿，離心（4 000 r/min，10 min），ELISA 試劑盒測(cè)定上清液中Wnt3a 和WISP1 的濃度，ELISA 結(jié)果用上清液中總蛋白濃度（BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)）進(jìn)行校正。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 表達(dá)未次給藥4 h 后處死小鼠，取小鼠背部皮膚，液氮迅速冷凍10 min，置入-80℃冰箱冷凍保存。采用高純總RNA 快速提取試劑盒（離心柱型）提取組織總RNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄獲到cDNA，設(shè)計(jì)特異性β-catenin 引物，β-catenin 正向引物為5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3'，反向引物為5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3'；內(nèi)參照Rn18s 正向引物為5'-CTATTTTGGTTTTCGGAACTGAG-3'，反向引物為5'-TTGGCAAATGCTTTCGCTCTG-3'。采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)，即相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。

1.5.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠皮膚組織β-catenin蛋白表達(dá)未次給藥4 h 后處死小鼠，取小鼠背部注射區(qū)皮膚，4%多聚甲醛中固定、脫水、包埋、切片。脫蠟，放入檸檬酸鈉液中，微波修復(fù)5 min，用3%H2O2封閉20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，β-catenin一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB 染色后用蘇木精復(fù)染。顯微鏡攝片后輸入計(jì)算機(jī)，Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析,求得積分光密度與組織面積的比值即平均光密度，各組平均光密度與空白對(duì)照組平均光密度的比值作為β-catenin的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt3a 和WISP1 濃度的比較

各組小鼠皮膚組織Wnt3a 和WISP1 濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SSc 模型組Wnt3a和WISP1 較空白對(duì)照組升高（P＜0.05）；刺山柑總生物堿中劑量組Wnt3a 較SSc 模型組降低（P＜0.05）；刺山柑總生物堿各劑量組、青霉胺組WISP-1與SSc 模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

各組小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SSc 模型組較空白對(duì)照組升高（P＜0.05），刺山柑總生物堿中劑量組、高劑量組及青霉胺組較SSc 模型組降低（P＜0.05）；刺山柑總生物堿中劑量組、高劑量組與青霉胺組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和圖1。

表1 各組小鼠皮膚組織Wnt3a 和WISP1 濃度比較（n =15，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與SSc 模型組比較，P ＜0.05。

組別 Wnt3a/（pg/mg） WISP1/（ng/mg）空白對(duì)照組 182.79±47.05 1.32±0.36 SSc 模型組 293.17±59.66① 2.02±0.40①刺山柑總生物堿低劑量組 300.73±46.77 1.93±0.32刺山柑總生物堿中劑量組 245.77±56.09② 1.89±0.35刺山柑總生物堿高劑量組 269.84±44.64 2.11±0.44青霉胺組 274.84±39.48 2.00±0.50 F 值 11.336 7.499 P 值 0.000 0.000

2.3 β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SSc 模型組較空白對(duì)照組升高（P＜0.05）；刺山柑總生物堿各劑量組及青霉胺組較SSc 模型組降低（P＜0.05）；刺山柑總生物堿各劑量組與青霉胺組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖2、3。

表2 各組小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n =15，±s）

表2 各組小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n =15，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與SSc 模型組比較，P ＜0.05。

組別 β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量空白對(duì)照組 1.00±0.00 SSc 模型組 2.50±0.39①刺山柑總生物堿低劑量組 2.30±0.40刺山柑總生物堿中劑量組 1.71±0.46②刺山柑總生物堿高劑量組 1.81±0.46②青霉胺組 1.37±0.39②F 值 10.620 P 值 0.000

圖1 小鼠皮膚組織β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n =15，±s）

表3 各組小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n =15，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與SSc 模型組比較，P ＜0.05。

組別 β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量空白對(duì)照組 1.00±0.00 SSc 模型組 5.66±1.82①刺山柑總生物堿低劑量組 2.71±0.98②刺山柑總生物堿中劑量組 3.69±1.70②刺山柑總生物堿高劑量組 2.47±0.95②青霉胺組 2.91±1.50②F 值 5.524 P 值 0.003

圖2 小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

圖3 小鼠皮膚組織β-catenin 蛋白表達(dá)情況 （免疫組織化學(xué)×100）

3 討論

系統(tǒng)性硬皮病呈現(xiàn)多組織、多器官進(jìn)行性纖維化，其病因與成纖維細(xì)胞異常增殖，膠原、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）過度合成并沉積有關(guān)[10-11]。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是成纖維細(xì)胞持續(xù)活化的關(guān)鍵途徑之一，在肺、皮膚等器官纖維化進(jìn)程中起重要作用[12]。研究表明，在系統(tǒng)性硬皮病皮膚和肺組織成纖維細(xì)胞中Wnt/β-catenin 通路被激活，β-catenin 水平升高，導(dǎo)致系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞中β-catenin 蓄積，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin 水平升高使目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄增加，引起系統(tǒng)性硬皮病組織纖維化[13-15]。Wnt3a 是Wnt 通路中的重要配體，WEI 等[16]和BAYLE 等[17]研究表明，Wnt3a/β-catenin 通路過度激活，可引起系統(tǒng)性硬皮病患者皮膚成纖維細(xì)胞增殖，ECM 合成增加，異常增多的Wnt3a 與受體結(jié)合激活β-catenin 可引發(fā)系統(tǒng)性硬皮病組織纖維化，是因?yàn)楹笳呖苫罨衫w維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，使ECM合成增多。本研究發(fā)現(xiàn)，SSc 模型組小鼠皮膚Wnt3a和β-catenin 表達(dá)升高，與上述研究結(jié)果一致；刺山柑總生物堿450 mg/kg 可降低系統(tǒng)性硬皮病小鼠皮膚Wnt3a的濃度；450 mg/kg和900 mg/kg可降低β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá)，提示刺山柑總生物堿對(duì)系統(tǒng)性硬皮病Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的過度激活有一定抑制作用。

WISP1，又名CCN4，是Wnt/β-catenin 下游靶蛋白，有研究表明，多組織器官的纖維化過程都與WISP1水平的異常升高有關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WISP1 在SSc模型組小鼠皮膚組織表達(dá)升高，提示W(wǎng)ISP1 可能參與系統(tǒng)性硬皮病皮膚纖維化的形成；刺山柑總生物堿組WISP1 表達(dá)與SSc 模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示刺山柑總生物堿可能不會(huì)改變系統(tǒng)性硬皮病小鼠WISP1的異常升高。