沈利聰，板得瑩，張瑜

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 婦科，湖南 長沙410008）

子宮內(nèi)膜異位癥是最常見的婦科慢性疾病之一，育齡期婦女發(fā)病率為10%～15%[1]。子宮內(nèi)膜異位癥主要引起疼痛、不孕和盆腔包塊，70%～93%青少年期女性痛經(jīng)因其引起，而15%～50%的女性不孕癥是由其導(dǎo)致[2]。據(jù)中國婦科疾病負擔調(diào)查顯示，子宮內(nèi)膜異位癥的疾病負擔為婦科疾病的第3 位[3]。子宮內(nèi)膜異位癥是良性疾病，卻具有惡性腫瘤的一些特性，如侵襲性、復(fù)發(fā)性及遠處轉(zhuǎn)移，約有1%患者可能惡變，被稱為“良性腫瘤”[4]。但目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制尚不清楚。

多種假說如經(jīng)血逆流種植學(xué)說、免疫學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、干細胞學(xué)說、細胞增殖與凋亡失衡等從不同角度闡釋可能引起子宮內(nèi)膜異位癥的病因及發(fā)病機制，然而，沒有一種學(xué)說能完全解釋其內(nèi)在機制[1，5]，表明子宮內(nèi)膜異位癥是一種多因素、多種機制參與導(dǎo)致的慢性疾病。RAS 相關(guān)蛋白1（Ras-associated protein 1, RAP1）是RAS 小G 蛋白家族中的一員，通過調(diào)節(jié)多種信號通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。RAP1由2 種異構(gòu)體組成，即RAP1A 和RAP1B。研究發(fā)現(xiàn)，RAP1A 在肝癌、胰腺癌、食管癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤中高表達，通過參與細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡失衡等多種生物學(xué)過程促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-11]。環(huán)磷酸腺苷交換蛋白1（the exchange protein directly activated by cAMP1, EPAC1）是一種非蛋白激酶A 依賴的信號分子，是環(huán)磷酸腺苷cAMP 的下游效應(yīng)分子。EPAC1 參與GDP/GTP 交換，將RAP1 結(jié)合的鳥苷二磷酸置換為鳥苷三磷酸，引起RAP1 激活。EPAC1/RAP1 通路參與細胞增殖、分化、黏附等多種生物學(xué)功能[12-14]。然而，RAP1A 和EPAC1 在子宮內(nèi)膜異位癥的作用尚無研究報道。

本研究通過免疫組織化學(xué)法及Western blotting 法檢測RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥及正常子宮內(nèi)膜的表達，并探討兩者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2019年6月—2020年1月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦科因卵巢子宮內(nèi)膜異位癥行腹腔鏡手術(shù)患者18 例，年齡22 ～45 歲，平均（32.72±4.95）歲；取異位及在位內(nèi)膜組織各18 份。取15 例卵巢單純性囊腫或畸胎瘤（鏡下未見卵巢及盆腔內(nèi)膜異位病灶）患者的子宮正常內(nèi)膜組織作為對照，年齡20 ～43 歲，平均（30.28±4.41）歲。所有組織經(jīng)甲醛固定、脫水后石蠟包埋。所有研究對象均為月經(jīng)周期規(guī)律的育齡期婦女，根據(jù)末次月經(jīng)及病理檢查證實所有內(nèi)膜組織均為增生期，術(shù)前3 個月未接受任何激素治療，術(shù)后病理檢查證實為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥或子宮正常內(nèi)膜。根據(jù)r-AFS 分期標準，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者均為Ⅲ、Ⅳ期。各組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查并批準執(zhí)行（#201910255）。

1.2 試劑及儀器

兔抗人RAP1A 單克隆抗體（MA1-103）購自美國Invitrogen 公司，兔抗人EPAC1 單克隆抗體（ab109415）購自美國Abcam 公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，HRP 標記山羊抗兔IgG、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。電泳儀購自北京六一儀器廠，掃描儀購自愛普生（中國）有限公司，顯微鏡購自德國Leica 公司，轉(zhuǎn)膜儀、圖像分析儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

石蠟包埋的組織標本進行4 μm 連續(xù)切片，將切片置于65℃恒溫箱烤片30 min，接著予松節(jié)油脫蠟、梯度酒精水化。切片經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)15 min，3%過氧化氫室溫孵育20 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，牛血清白蛋白封閉20 min，一抗孵育（RAP1A 按1 ∶200 稀釋，EPAC1 按1 ∶100 稀釋，陰性對照用PBS 代替一抗）4℃冰箱過夜，37℃復(fù)溫45 min，清洗后加入二抗室溫孵育1 h。最后，經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片后，倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

每張切片計數(shù)5 個高倍鏡視野（×40），染色結(jié)果判讀采用免疫反應(yīng)評分（IRS），分別記錄染色強度（SI）和陽性細胞百分比（PP）。陽性結(jié)果為細胞核、細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒，每次閱片時需保證白平衡、亮度等參數(shù)設(shè)置一致。根據(jù)陽性信號強弱將染色強度分為4 個等級：0 分為陰性，1 分為弱陽性，2 分為中度陽性，3 分為強陽性。根據(jù)陽性細胞所占百分比分為5 個等級：0 分，＜5%；1 分，5% ～25%；2 分，＞25% ～50%；3 分，＞50%～75%；4 分，＞75%。最后計算IRS 值，IRS=SI×PP，獲得組織染色半定量評分。IRS 為0 ～12 分，IRS ≤3 分定義為低表達，IRS＞3 分定義為高表達。

1.4 Western blotting 檢測

組織剪碎后加入RIPA 裂解液，置于冰上裂解，離心后提取總蛋白；用BCA 蛋白定量試劑盒測蛋白濃度；將蛋白溶液按照4 ∶1 的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性；取50 μg 總蛋白行SDSPAGE 電泳；恒壓100 V 轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂牛奶封閉1 h；1 ∶1 000 稀釋RAP1A 一抗，1 ∶1 000 稀釋EPAC1 一抗，1 ∶1 000 稀釋GAPDH 一抗，4℃孵育過夜；在室溫下用TBST 洗膜3 次，加入1 ∶3 000稀釋的二抗，于搖床上室溫孵育1.5 h；用TBST 洗膜3 次，加入ECL 溶液進行顯色反應(yīng)，曝光，最后顯影和定影。保存圖片并用Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標蛋白條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組內(nèi)膜RAP1A 的表達

RAP1A 表達于細胞質(zhì)，在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達明顯高于正常內(nèi)膜，在在位內(nèi)膜腺上皮細胞呈強陽性表達（見圖1）。免疫組織化學(xué)半定量評分顯示，異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的IRS 分別為（5.688±0.651）分、（8.700±1.144）分、（0.787±0.053）分，3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=45.005，P=0.009）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜的IRS 水平均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見圖2）。

2.2 各組內(nèi)膜EPAC1 的表達

圖1 RAP1A 在各組內(nèi)膜的表達 （免疫組織化學(xué)×40）

圖2 RAP1A 在各組內(nèi)膜的IRS 比較 （±s）

EPAC1 在腺上皮細胞的細胞質(zhì)表達，在間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)和細胞核都有表達；其在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達明顯高于正常內(nèi)膜，在腺上皮細胞的細胞質(zhì)呈強陽性表達（見圖3）。免疫組織化學(xué)半定量評分顯示，異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的IRS 分別為（8.100±1.153）分、（8.878±1.829）分、（2.520±0.138）分，3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=42.850，P=0.002）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見圖4）。

2.3 各組內(nèi)膜RAP1A 蛋白相對表達量的比較

RAP1A 在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的蛋白相對表達量分別為（0.518±0.059）、（0.479±0.381）、（0.177±0.012），3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.664，P=0.006）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

2.4 各組內(nèi)膜EPAC1 蛋白相對表達量的比較

EPAC1 在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的蛋白相對表達量分別為（0.813±0.067）、（0.829±0.052）及（0.228±0.041），3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.069，P=0.005）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖3 EPAC1 在各組內(nèi)膜的表達 （免疫組織化學(xué)×40）

圖4 EPAC1 在各組內(nèi)膜的IRS 比較 （±s）

圖5 各組內(nèi)膜中RAP1A 和EPAC1 的表達

2.5 RAP1A 和EPAC1 表達的相關(guān)性

采用Pearson 法對RAP1A 和EPAC1 在各組內(nèi)膜的表達分別進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：RAP1A 和EPAC1 的表達在異位內(nèi)膜（r=0.635，P=0.033）和在位內(nèi)膜（r=0.697，P=0.005）及正常內(nèi)膜（r=0.436，P=0.018）均呈正相關(guān)。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女的常見病，在育齡期長期處于活躍狀態(tài)，由于發(fā)病機制尚不明確，目前臨床尚缺乏針對性的、長期有效的生物治療手段。尋找在子宮內(nèi)膜異位癥差異表達的分子，探索可能的治療生物靶點，具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的表達升高，表明其可能參與疾病的發(fā)病過程。

RAP1A 通過調(diào)控多種分子信號通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。RAP1A 通過激活ERK/MAPK/Notch 信號通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進卵巢癌生長和轉(zhuǎn)移[11]。RAP1A 基因多態(tài)性導(dǎo)致肝移植后肝癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險升高[6]。LI 等[9]通過體內(nèi)及體外實驗發(fā)現(xiàn)，RAP1A 可通過激活A(yù)kt 信號通路促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、刺激細胞遷移和侵襲，從而促進食管癌的轉(zhuǎn)移。LIU等[15]發(fā)現(xiàn)RAP1A 在結(jié)直腸癌高表達，并揭示其通過激活PTEN/FOXO3/CCND1 通路促進結(jié)直腸癌的侵襲。劉立果[16]發(fā)現(xiàn)RAP1A 可通過PTEN/FOXO3/CCND1信號通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，并通過臨床回顧分析發(fā)現(xiàn)RAP1A 可作為結(jié)直腸癌患者總體生存的獨立預(yù)后因素。有研究進一步發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細胞敲除RAP1A 后，癌細胞的增殖、黏附和侵襲能力下降[17]。上述研究表明，RAP1A在細胞增殖、侵襲、黏附等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RAP1A 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達高于正常內(nèi)膜，提示RAP1A 可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的細胞增殖、侵襲、黏附等過程。有趣的是，孫樹凱等[18]發(fā)現(xiàn)脊髓神經(jīng)損傷小鼠的RAP1A 表達升高，機械痛閾明顯降低，而脊髓組織分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞的自噬標志分子表達及自噬水平均升高，表明RAP1A 高表達促進神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展，該過程可能與RAP1A 對星形膠質(zhì)細胞自噬水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，筆者推測，RAP1A 在子宮內(nèi)膜異位癥高表達，不僅參與疾病的發(fā)生過程，還可能通過自噬參與痛經(jīng)的發(fā)生過程，后續(xù)進一步研究RAP1A 及自噬在子宮內(nèi)膜異位癥的作用將可能揭示發(fā)生痛經(jīng)的新機制。

EPAC1 是細胞內(nèi)一種非依賴PKA 的介導(dǎo)cAMP 效應(yīng)的重要分子，在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮核心作用[19-20]。EPAC1 可活化鳥苷三磷酸酶，促進RAP1A 結(jié)合鳥苷三磷酸變成活化形式。EPAC1基因缺失在體外抑制微血管形成，在病理性血管生成的進展中起關(guān)鍵作用。EPAC1-RAP1A-NHE3通路可能調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的表達，促進腎小管間質(zhì)炎癥發(fā)生[21]。在結(jié)直腸癌中，EPAC1 呈高表達，且對評估患者預(yù)后具有重要價值[22]。近年來，多個研究發(fā)現(xiàn)EPAC1 激活可能引起痛覺受體過敏，從而導(dǎo)致機體疼痛發(fā)生[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達高于正常內(nèi)膜，推測其可能通過促進腹腔子宮內(nèi)膜異位癥病灶新生微血管生成參與子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程。本研究發(fā)現(xiàn)，EPAC1 與RAP1A 的表達呈正相關(guān)，推測兩者可能相互協(xié)同，共同促進子宮內(nèi)膜細胞增殖、侵襲和黏附過程。最近研究表明[25]，炎癥在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用，EPAC1 高表達也可能通過促進炎癥過程而參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生及發(fā)展。子宮內(nèi)膜異位癥引起疼痛的確切機制尚不清楚，RAP1A 及EPAC1兩者高表達，可能協(xié)同參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的慢性疼痛。

在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制研究中，“經(jīng)血逆流種植學(xué)說”是最早被廣泛接受的學(xué)說，活性的子宮在位內(nèi)膜通過輸卵管逆流到腹腔，在腹腔環(huán)境下，需經(jīng)過黏附、侵襲和血管形成才能在腹膜或卵巢等盆腹腔形成異位病灶。在該過程中，在位內(nèi)膜的分子生物學(xué)特征起重要作用，決定了異位內(nèi)膜的生物學(xué)行為，這就是郎景和院士提出的經(jīng)典的“在位內(nèi)膜決定論”[26]。本研究中，異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜RAP1A 和EPAC1 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明兩者在異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的表達均具有相似的特征，進一步證實在位內(nèi)膜是子宮內(nèi)膜異位癥的根源，符合“在位內(nèi)膜決定論”學(xué)說。由此可見，RAP1A 和EPAC1 可能成為子宮內(nèi)膜異位癥潛在的分子診斷和治療靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中高表達，且兩者的表達呈正相關(guān)，推測RAP1A 和EPAC1 可能相互協(xié)同，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展及痛經(jīng)的調(diào)控過程。EPAC1 表達升高，可能加速置換鳥苷三磷酸，促進RAP1A 激活，進而增強在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜細胞的增殖、侵襲、黏附及新生微血管形成能力，還可能通過調(diào)節(jié)細胞自噬參與痛經(jīng)的發(fā)生發(fā)展。本研究為進一步探索子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制及探索可能的治療新靶點提供了思路。