高小卓，張輝，喬鋆，王楠，楊世華，張繼福，馬詩(shī)揚(yáng)，李記彬，石剛，張睿

[1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院（遼寧省腫瘤醫(yī)院） 病理科，遼寧 沈陽(yáng) 110044；2.丹東市人民醫(yī)院 呼吸腫瘤科，遼寧 丹東 118000；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院（遼寧省腫瘤醫(yī)院） 結(jié)直腸外科，遼寧 沈陽(yáng) 110044]

結(jié)直腸癌在全球發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，隨著化療及靶向治療藥物的發(fā)展，整體生存率較10 余年前有明顯升高[1]。對(duì)結(jié)直腸癌早期診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志物的探索，以及對(duì)靶向治療靶點(diǎn)的研究可能是進(jìn)一步提高晚期結(jié)直腸癌患者生存率的主要方向[2]。MicroRNA 可以對(duì)靶mRNA 3'-UTR 端進(jìn)行特異性識(shí)別，其組成為單鏈非編碼RNA 長(zhǎng)度為18 ～22 個(gè)核苷酸，對(duì)下游靶mRNA 降解進(jìn)行調(diào)控或接受上游基因的調(diào)控，阻斷翻譯過(guò)程，對(duì)惡性腫瘤的行為有重要的調(diào)控作用[3]。有研究顯示，microRNA-93（miR-93）能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展有重要聯(lián)系[4]。四跨膜蛋白超家族成員Tspan1 是細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)的重要通路，對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲等行為具有調(diào)控作用，有研究顯示Tspan1 在胰腺癌中表達(dá)升高，并與侵襲、轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[5-6]。本研究對(duì)組織及細(xì)胞中miR-93 及Tspan1 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系及兩者的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究miR-93 與Tspan1 的靶向調(diào)控關(guān)系提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2016年5月—2018年4月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科行結(jié)腸癌根治術(shù)的患者74 例，取其手術(shù)標(biāo)本，包括結(jié)腸癌組織及對(duì)應(yīng)的距腫瘤邊緣＞5 cm 的癌旁組織。人結(jié)腸癌細(xì)胞株（SW480、SW620、HCT116、CaCo-2、LoVo、HT29）購(gòu) 自 中 國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株（FHC）購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司，于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代擴(kuò)增。Tspan1 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，BCA 蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自北京博凌科為公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas 公司，microRNA 提取分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcom 公司，All-in-One qPCR Mix 試劑盒及MTT 試劑盒購(gòu)自大連寶生生物技術(shù)有限公司，引物由大連寶生生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（No：20180336）。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting取組織或細(xì)胞株，將組織或細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后做蛋白濃度定量。使用裂解液對(duì)蛋白進(jìn)行裂解、震蕩、充分搖勻，完成總蛋白的提取，然后提取上清液，應(yīng)用BCA 蛋白定量分析試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量。使用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%的脫脂奶粉在室溫下封閉90 min，加一抗，孵育過(guò)夜，TBST洗滌加二抗，再次孵育，再用TBST 洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯色，以β-actin 為內(nèi)參照。以Quantity One 監(jiān)測(cè)灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。

1.2.2 qRT-PCR取組織或細(xì)胞標(biāo)本，使用Trizol試劑盒進(jìn)行總RNA 提取及純化，嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)操作，使用DNasel 去除污染的DNA，分光光度計(jì)檢查OD 260/280=1.8 ～2.0，無(wú)蛋白和苯酚污染，甲醛變性瓊脂糖電泳法檢測(cè)RNA 完整性，后立即逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得樣本cDNA 產(chǎn)物，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。按照All-in-One qPCR Mix 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物。采用2-ΔΔCt法分析熔解曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件為T(mén)argetScan 及GeneCard。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在結(jié)腸癌、癌旁組織中的表達(dá)

miR-93 在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.33，P=0.000），miR-93 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)較低。Tspan1 mRNA 在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.312，P=0.000），Tspan1 mRNA 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)較高。Tspan1 蛋白相對(duì)表達(dá)量在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.980，P=0.000），Tspan1 蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)較高。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結(jié)腸癌細(xì)胞株、正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)

miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結(jié)腸癌細(xì)胞株（SW480，SW620，HCT116，CaCo-2，LoVo，HT-29）及正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株（FHC）中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.098、4.576 和5.516，均P=0.000）。與正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株比較，miR-93 在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)較低（P＜0.05）；Tspan1 mRNA 在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)較高（P＜0.05）；Tspan1 蛋白在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)較高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 miR-93 及Tspan1 mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中miR-93 及Tspan1 mRNA 在患者不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、腫瘤浸潤(rùn)深度、病理分型、腫瘤分化程度患者中的表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05），miR-93 在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、血管浸潤(rùn)陽(yáng)性及高TNM 分期患者中的表達(dá)低（P＜0.05），Tspan1 mRNA 在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、血管浸潤(rùn)陽(yáng)性及高TNM 分期患者中的表達(dá)高（P＜0.05）。miR-93 及Tspan1 mRNA 在結(jié)腸癌是否具有血行及淋巴轉(zhuǎn)移的臨床病理特征表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 miR-93 與Tspan1 mRNA 相關(guān)性分析及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

采用Pearson 法對(duì)miR-93 與Tspan1 mRNA 進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中，miR-93 與Tspan mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[r=-0.735（95% CI：-0.855，-0.535），P=0.000]。經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，miR-93 及Tspan1 在3'-UTR 區(qū)可能具有靶向調(diào)控關(guān)系。見(jiàn)圖2。

圖1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

表1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結(jié)腸癌細(xì)胞株及正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株中的表達(dá) （±s）

表1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結(jié)腸癌細(xì)胞株及正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株中的表達(dá) （±s）

指標(biāo) SW480 SW620 HCT116 CaCo-2 LoVo HT-29 FHC miR-93 0.468±0.199 0.488±0.136 0.688±0.199 0.403±0.046 0.522±0.217 0.494±0.168 1.287±0.142 Tspan1 mRNA 1.140±0.383 1.203±0.147 0.928±0.201 0.866±0.298 0.696±0.154 1.024±0.151 0.399±0.049 Tspan1 蛋白 16.301±4.516 19.314±3.068 18.602±2.945 15.961±2.952 15.343±0.571 12.268±3.104 7.598±2.016

表2 結(jié)腸癌患者臨床病理特征與miR-93 及Tspan1 mRNA 表達(dá)的關(guān)系 （±s）

臨床病理特征 n miR-93 t /F 值 P 值 Tspan1 mRNA t / F 值 P 值性別男40 0.314±0.208 1.732 0.088 0.576±0.290 1.531 0.130女34 0.242±0.137 0.671±0.233年齡≤60 歲 42 0.273±0.169 0.623±0.235 0.412 0.682 0.130 0.897＞60 歲 32 0.291±0.199 0.615±0.310腫瘤位置左半結(jié)腸 42 0.272±0.206 0.640±0.297 0.474 0.637 0.725 0.471右半結(jié)腸 32 0.293±0.146 0.594±0.226腫瘤直徑≤5 cm 48 0.276±0.172 0.623±0.254 0.330 0.743 0.128 0.899＞5 cm 26 0.291±0.201 0.614±0.298浸潤(rùn)深度T1、T2 22 0.242±0.109 0.639±0.161 1.204 0.233 0.392 0.696 T3、T4 52 0.298±0.203 0.612±0.304淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0 42 0.340±0.179 0.534±0.240 3.022 0.003 3.375 0.001 N1、N3 32 0.212±0.163 0.733±0.265遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0 58 0.317±0.180 0.561±0.248 3.525 0.001 3.937 0.000 M1 16 0.149±0.116 0.833±0.235血管浸潤(rùn)陰性 38 0.330±0.191 2.442 0.017 0.562±0.262 2.305 0.024陽(yáng)性 36 0.230±0.157 0.700±0.251 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期 32 0.350±0.213 0.524±0.290 2.995 0.004 3.165 0.002Ⅲ、Ⅳ期 42 0.229±0.133 0.709±0.212大體形態(tài)分類(lèi)腫塊型 36 0.342±0.182 0.594±0.243潰瘍型 20 0.199±0.156 0.987 0.330 0.792±0.234 1.322 0.190浸潤(rùn)型 18 0.251±0.171 0.505±0.276分化程度高、中 40 0.288±0.197 0.352 0.726 0.625±0.280 0.149 0.882低34 0.273±0.164 0.634±0.247

圖2 miR-93 與Tspan1 mRNA 相關(guān)性分析及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

3 討論

結(jié)直腸癌目前是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，化療藥物及靶向藥物的發(fā)展是晚期結(jié)直腸癌患者生存期延長(zhǎng)的最主要原因[7-9]。miRNA 具有表達(dá)穩(wěn)定的特征，對(duì)腫瘤發(fā)生及發(fā)展具有重要調(diào)控作用，并參與惡性腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控[10-11]。miRNA 在惡性腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)及靶向治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[12-13]。XIANG 等[14]研究結(jié)果顯示，miR-93會(huì)抑制SW1116 干細(xì)胞增殖及克隆形成，是抑癌基因。以往研究報(bào)道[15]Tspan1 在胰腺癌中與臨床分期呈正相關(guān)，與癌癥患者的生存率呈負(fù)相關(guān)，對(duì)胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用是通過(guò)調(diào)控MMP2 表達(dá)及PLCγ 磷酸化實(shí)現(xiàn)，Tspan1是一種促癌基因。另有研究顯示[16]，miR-200a 可以通過(guò)調(diào)控Tspan1 表達(dá)誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移，表明Tspan1 對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的調(diào)控可以受到上游miRNA 的調(diào)控。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-93 及Tspan1 在3'-UTR 區(qū)可能具有靶向調(diào)控關(guān)系，本研究分析了結(jié)腸癌患者臨床病理特征與miR-93及Tspan1 mRNA 表達(dá)的關(guān)系，把兩者在信號(hào)通路方面的靶向調(diào)控關(guān)系作為前期實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

本研究顯示,與癌旁組織比較，miR-93 在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，Tspan1 mRNA 及蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，與正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞比較，miR-93 在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中低表達(dá)，Tspan1 mRNA 及蛋白在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中高表達(dá)。miR-93 在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、血管浸潤(rùn)陽(yáng)性及高TNM 分期患者中表達(dá)低，Tspan1 mRNA 在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、血管浸潤(rùn)陽(yáng)性及高TNM 分期患者中表達(dá)高。這部分研究表明，miR-93 可能與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的惡性行為有關(guān)，可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，而Tspan1 可能作為促癌基因發(fā)揮作用。YANG 等[17]研究顯示，在前列腺癌中，miR-93 是重要的預(yù)測(cè)因子及預(yù)后因子，在前列腺癌中低表達(dá)，miR-93 對(duì)KEGG 通路的靶向調(diào)控作用可能是前列腺癌靶向治療的候選基因。CHEN 等[18]在胃癌的研究中顯示，Tspan1 高表達(dá)的患者中位生存期短，TNM分期更差。CHEN等[19]在肝癌的研究中也顯示，Tspan1 高表達(dá)的肝癌患者生存期短。SCHOLZ 等[20]在卵巢癌的研究中顯示，Tspan1 是轉(zhuǎn)移性卵巢癌不良預(yù)后的標(biāo)志物，可能作為未來(lái)的治療靶點(diǎn)。本研究顯示，miR-93 與Tspan mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，miR-93 及Tspan1 在3'-UTR 區(qū)可能具有靶向調(diào)控關(guān)系。在進(jìn)化上miRNA 是高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，對(duì)基因的調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄后水平。在基因組中，miRNA 具有不同編碼，編碼miRNA 前體（premiRNA）。pre-miRNA 是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且是單一的，5'-端具備磷酸基團(tuán)，3'-具備突出堿基2個(gè)及3'-羥基1個(gè)，miRNA 可以抑制mRNA 的蛋白傳遞，這是通過(guò)與靶mRNA3'-UTRs 互補(bǔ)結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而抑制或破壞mRNA 蛋白傳遞，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[21-22]。miRNA 表達(dá)失調(diào)與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展具有相關(guān)性。有研究顯示，在乳腺癌中，miR-93 通過(guò)抑制MKL-1 及STAT3 表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞表皮間質(zhì)化形成，從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與化療耐藥也具有相關(guān)性[14]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-93與Tspan1 可能存在調(diào)控關(guān)系，在組織水平觀察兩者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并分析兩者與臨床病理特征的關(guān)系，從統(tǒng)計(jì)學(xué)方面論證兩者的相關(guān)性，為結(jié)直腸癌的診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)靶基因的發(fā)現(xiàn)，為治療靶向候選基因的探索，提供臨床實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步的在體實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

綜上所述，miR-93 在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，Tspan1在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，miR-93 可能與Tspan1 mRNA具有靶向調(diào)控關(guān)系，兩者可能成為結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物或預(yù)測(cè)因子，可以通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明其是否可以成為靶向治療的靶點(diǎn)。