蘭天俊，劉 鑫，陳之鋒

成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma, AM)是一種口腔頜面部常見的牙源性良性頜骨腫瘤，來源于釉質(zhì)器或者牙板上皮，常常表現(xiàn)為初期無自覺感覺的緩慢生長，逐漸向周圍膨脹，導(dǎo)致頜骨膨大，造成頜面部畸形[1-3]。臨床發(fā)現(xiàn)成釉細(xì)胞瘤具有局部侵襲性、術(shù)后高復(fù)發(fā)率以及偶見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，故又被稱為“臨界瘤”。牙源性角化囊腫(odontogenic keratocyst, OKC)是一種口腔頜面部常見的牙源性囊腫，來源于原始的牙胚或牙板殘余，也是在發(fā)病初期無明顯癥狀的緩慢生長，逐漸增大，最終導(dǎo)致一系列癥狀[3-4]。因其組織表現(xiàn)為不全角化的復(fù)層鱗狀上皮，并具有浸潤性生長和局部復(fù)發(fā)的生物學(xué)行為，曾一度被國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為是牙源性腫瘤，2017版WHO牙源性腫瘤新分類中將其重新歸為牙源性囊腫[1,3,5]。臨床診療中，往往需要將成釉細(xì)胞瘤與牙源性角化囊腫進(jìn)行鑒別診斷，兩者在臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)上存在一定的相似性，并且角化囊腫能轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛲瑫r(shí)伴有成釉細(xì)胞瘤，導(dǎo)致診斷難度增大。另外根據(jù)口腔頜面功能外科的要求，由于角化囊腫并非良性腫瘤，臨床治療可偏向相對保守的治療。因此尋找兩者間的特異性標(biāo)志物不僅有助于精準(zhǔn)診斷，還有助于精準(zhǔn)治療。此外通過尋找兩者之間的差異基因，篩選出與成釉細(xì)胞瘤侵襲生長相關(guān)的標(biāo)志物，可為臨床治療成釉細(xì)胞瘤和牙源性角化囊腫提供新的思路。

目前對于成釉細(xì)胞瘤和牙源性角化囊腫的發(fā)病和術(shù)后復(fù)發(fā)機(jī)制尚未明確。既往有研究發(fā)現(xiàn)BRAF V600E在含成釉細(xì)胞的牙源性腫瘤中特異性高表達(dá)，認(rèn)為其是成釉細(xì)胞瘤的特異性分子標(biāo)志物[6-7]。Kaye等[8]認(rèn)為BRAF V600E有希望成為治療成釉細(xì)胞瘤的靶點(diǎn)。他們對1例肺轉(zhuǎn)移的成釉細(xì)胞瘤患者使用BRAF V600E突變的靶向藥物20周后，口腔原發(fā)灶與肺轉(zhuǎn)移瘤體明顯縮小。但是由于角化囊腫存在轉(zhuǎn)變?yōu)榛虬橛谐捎约?xì)胞瘤的現(xiàn)象，這對臨床運(yùn)用BRAF V600E診斷造成了一定困難。而對于牙源性角化囊腫，抑癌基因PTCH的突變過去被認(rèn)為是在牙源性角化囊腫中特異性表達(dá)，隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PTCH突變多見于痣樣基底細(xì)胞癌綜合癥患者，在散發(fā)的牙源性角化囊腫患者中并不多見[6,9]。目前還未有一個(gè)明確的特異性標(biāo)志物來進(jìn)行兩者的診斷。

生物信息學(xué)是近年來迅速發(fā)展起來的在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對生物信息進(jìn)行儲存、檢索和分析的一門新興學(xué)科，其研究重點(diǎn)是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。在腫瘤領(lǐng)域，生物信息學(xué)分析已經(jīng)得到了廣泛的運(yùn)用，通過高通量的運(yùn)算來獲得大量的基因表達(dá)信息，進(jìn)而鑒定其中的遺傳變異，并探索與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因變化。近年來越來越多的學(xué)者運(yùn)用生物信息學(xué)分析來探究各種癌癥的表達(dá)差異基因，并研究這些基因在分子功能、細(xì)胞組成以及生物過程中所發(fā)揮的作用[10-11]。

為此，我們從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出成釉細(xì)胞瘤和牙源性角化囊腫間的差異基因(different expression genes, DEGs)，并對這些差異基因進(jìn)行基因本體論分析(Gene Oncology, GO)和京都基因和基因組百科全書分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)，之后構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction, PPI)進(jìn)一步篩選出核心功能基因(hub genes)。

1 資料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)來源

本研究所使用的芯片數(shù)據(jù)GSE38494[12]來自于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed),使用GPL570平臺(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，包含15個(gè)成釉細(xì)胞瘤組織樣本，12個(gè)散發(fā)牙源性角化囊腫組織樣本，1個(gè)痣樣基底細(xì)胞癌綜合癥患者組織樣本，1個(gè)成釉細(xì)胞纖維牙瘤組織樣本，4個(gè)正常組織樣本和2個(gè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織樣本。在本研究中，我們選取了其中的15個(gè)成釉細(xì)胞瘤組織樣本和12個(gè)散發(fā)牙源性角化囊腫組織樣本。

1.2 差異基因分析

使用R軟件讀取上述27個(gè)組織樣本基因芯片數(shù)據(jù)，使用LIMMA數(shù)據(jù)分析包進(jìn)行差異基因分析[13]。將成釉細(xì)胞瘤組作為實(shí)驗(yàn)組，牙源性角化囊腫組作為對照組，以P<0.01和差異倍數(shù)log FC>2作為篩選條件來選取差異基因。

1.3 GO分析和KEGG分析

在線分析工具DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)對所獲得的差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，并以篩選條件為P<0.01選出顯著富集結(jié)果[14]。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

我們使用交互基因檢索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING)網(wǎng)站(http://string-db.org)構(gòu)建差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)[15]。之后Cytoscape軟件進(jìn)行結(jié)果可視化，并使用MCODE插件篩選其中的關(guān)鍵基因(Hub genes)[16]。GenCLiP2數(shù)據(jù)庫用來進(jìn)一步富集Hub基因功能,篩選條件為P<1×10-4[17]。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因

首先，我們對27個(gè)樣本進(jìn)行了主成分分析，具體結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示成釉細(xì)胞瘤與牙源性角化囊腫間基因表達(dá)存在明顯差異。

紅色：牙源性角化囊腫；綠色：成釉細(xì)胞瘤圖1 成釉細(xì)胞瘤樣本與牙源性角化囊腫樣本間的主成分分析Fig.1 Principal component analysis between ameloblastoma and odontogenic keratocyst samples

之后我們通過LIMMA包進(jìn)行成釉細(xì)胞瘤對比牙源性角化囊腫的差異基因篩選，獲得了335個(gè)差異基因，并將相應(yīng)結(jié)果用下表展示(表1)。

表1 成釉細(xì)胞瘤與牙源性角化囊腫間的335個(gè)差異基因Tab.1 355 DEGs between ameloblastoma and odontogenic keratocyst

2.2 差異基因的GO分析及KEGG分析

利用DIVID 6.8分別對335個(gè)差異基因做GO分析及KEGG分析。

2.2.1 GO分析結(jié)果 335個(gè)差異基因富集的GO條目有216條，以P<0.01作為篩選條件，56條顯著富集通路被選出，其中39條(69.6%)富集在生物過程，包括神經(jīng)元分化、細(xì)胞粘附、生物粘附、與分化有關(guān)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞命運(yùn)鎖定等；14條(25.0%)富集在細(xì)胞組成，包括細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外組分、蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成、突觸等；3條(5.4%)富集在分子功能，包括碳水化合物結(jié)合、肝素結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性。選取顯著富集生物過程、細(xì)胞組成和分子功能前6的條目，詳見表2。

表2 差異基因的GO富集分析結(jié)果Tab.2 GO enrichment analysis of DEGs

2.2.2 KEGG分析結(jié)果 335個(gè)差異基因富集到KEGG通路有11個(gè)，以P<0.01作為篩選條件，3條顯著富集通路被選取，包括細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、軸突導(dǎo)向和癌癥通路(表3)。

表3 差異基因的KEGG通路分析Tab.3 KEGG pathway analysis of DEGs

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將335個(gè)差異基因上傳至STRING網(wǎng)站進(jìn)行蛋白相互作用分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化(圖2)，并使用MCODE插件篩選出8個(gè)Hub基因，分別為：SPARCL1、SERPINA1、ITIH2、IGFBP5、LAMB1、C3、GOLM1、FAM20A(圖3)。將差異基因的Hub基因?qū)隚enCLiP2.0中進(jìn)行功能富集，篩選條件為P<0.05，結(jié)果顯示Hub基因與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)(圖4)。

圖2 差異基因的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The PPI network of DEGs

圖3 Hub基因Fig.3 Hub genes

綠色：基因富集到的條目；黑色：基因未富集到的條目圖4 Hub基因的功能富集Fig.4 The function enrichment of Hub genes

3 討 論

在本研究中，我們將成釉細(xì)胞瘤作為實(shí)驗(yàn)組，牙源性角化囊腫作為對照組，來探究兩者間的差異基因。通過對GEO數(shù)據(jù)的分析，335個(gè)差異基因被發(fā)現(xiàn)。之后對差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。最后進(jìn)行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過MCODE插件篩選出其中的Hub基因。一共有8個(gè)Hub基因被確定：SPARCL1、SERPINA1、ITIH2、IGFBP5、LAMB1、C3、GOLM1和FAM20A。

通過基因功能富集分析，我們發(fā)現(xiàn)相對于牙源性角化囊腫，成釉細(xì)胞瘤的335個(gè)差異基因的生物過程主要集中細(xì)胞自身這一方面，如細(xì)胞粘附、生物粘附、與分化有關(guān)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞命運(yùn)鎖定等；細(xì)胞組成集中在腫瘤微環(huán)境相關(guān)的條目，如細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外組分、蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成等。另外KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集于細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用和癌癥通路。這些結(jié)果與成釉細(xì)胞瘤的腫瘤臨床特性有關(guān)，也說明本研究所篩選的差異基因參與成釉細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程。

細(xì)胞外基質(zhì)是指由動物細(xì)胞分泌至細(xì)胞周圍的大分子物質(zhì)，主要由膠原蛋白、非膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖與氨基聚糖這五種物質(zhì)組成，是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分[18]。有研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)不僅僅只是在細(xì)胞間發(fā)揮惰性支持物的作用，還對細(xì)胞的功能、存活、增殖、分化和轉(zhuǎn)移等有調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞外基質(zhì)能夠相互連接，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)來支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各項(xiàng)功能活動和組織的發(fā)生發(fā)展[19-21]。目前已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞外基質(zhì)中的彈性纖維與一些普外科疾病如內(nèi)痔、腹股溝疝等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22]。在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞將細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而突破細(xì)胞外基質(zhì)是其中非常關(guān)鍵的一環(huán)[23-24]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，在成釉細(xì)胞瘤中，MMP-2和MMP-9均有表達(dá)，這也一定程度上解釋了為什么成釉細(xì)胞瘤具有局部侵襲性、術(shù)后高復(fù)發(fā)率以及偶見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[25]。在本研究中，8個(gè)Hub基因有6個(gè)基因與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)。

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白類似蛋白1(SPARCL1)是富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC)家族成員，是一種小分子糖蛋白，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞發(fā)育與遷移和血管生成等生理過程[26]。研究發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤組織中，SPARCL1均有不同程度的表達(dá)[27-28]。Turtoi等[27]對腦膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)SPARCL1在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。而在乳腺癌中，與癌旁組織相比，SPARCL1在腫瘤組織呈低表達(dá)[28]。絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(SERPINA1)，是一種血漿蛋白，主要在肝細(xì)胞中合成。由于其具有高度保守性，并且參與抑制血漿蛋白酶活性，被認(rèn)為是一種抑癌基因[29-30]。目前已經(jīng)證實(shí)SERPINA1在多種癌癥組織中高表達(dá)[29-30]。人類中間胰蛋白酶抑制劑H2重鏈(ITIH2)，是血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一員，參與穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)和預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。其在正常乳腺、子宮、卵巢、肺和腎組織中均有表達(dá)，而在乳腺癌、肺癌、腎腫瘤、胃癌、直腸癌和前列腺癌中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)[31]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-5(IGFBP5)屬于胰島素樣生長因子類(IGF)家族，在上皮生長過程中發(fā)揮著絲裂原和抗凋亡的作用，已知在多種腫瘤中有不同程度的表達(dá)，與腫瘤的生長相關(guān)[32]。目前發(fā)現(xiàn)IGFBP5在卵巢癌、宮頸癌、腦膜瘤等腫瘤中能夠起到抑癌作用[32]。層粘連蛋白β1(LAMB1)是細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白家族層粘連蛋白的一員，主要構(gòu)成基底膜中的非膠原成分，參與細(xì)胞粘附、趨化、遷移、信號傳導(dǎo)等過程[33-34]。在腫瘤組織中，LAMB1作為67-kDa層粘連蛋白單體受體的配體在多種轉(zhuǎn)移性癌癥中高表達(dá)，并催動癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成[34]。補(bǔ)體系統(tǒng)是存在于血清中能夠輔助抗體所介導(dǎo)的溶菌作用的一組需經(jīng)活化后才具有酶活性的蛋白質(zhì)。補(bǔ)體成分C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的中心分子，含量最高，也是啟動旁路途徑的關(guān)鍵分子[35]。在腫瘤患者中，補(bǔ)體量會升高，肝癌患者中C3含量升高最為明顯，被認(rèn)為是診斷標(biāo)志物[36]。高爾基體膜蛋白1(GOLM1)是一種上皮細(xì)胞特異性Ⅱ型高爾基體跨膜糖蛋白，主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成后修飾，以及協(xié)助高爾基體完成蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)GOLM1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌、肝癌、腎癌及肺癌等惡性腫瘤組織中顯著高表達(dá)，有望在未來成為早期診斷標(biāo)志物[37-38]。序列相似家族20成員A(FAM20A)屬于FAM20(Family with Sequence Similarity 20)家族成員，是一種沒有激酶活性的假激酶，通過與FAM20C形成功能性復(fù)合物來激活其活性。目前已知FAM20A突變將導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育不良、牙齦纖維瘤和釉腎綜合征[39]。迄今為止，上述8個(gè)Hub基因雖然在其他疾病得到不同程度的研究，但是在成釉細(xì)胞瘤中尚未研究它們在其發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用。盡管如此，本研究的成果一定程度上能為成釉細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展研究提供新的思路。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，篩選出了成釉細(xì)胞瘤和牙源性角化囊腫之間的差異基因，并對其功能進(jìn)行了相關(guān)分析，雖然所篩選的基因目前并未被證實(shí)參與成釉細(xì)胞瘤發(fā)展過程，但是這也提示著這些基因可能是新的研究靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)也為成釉細(xì)胞瘤和牙源性角化囊腫的鑒別診斷提供了一些新的角度。