李 芳，關(guān) 爽

口腔癌(oral cancer)是頜面部常見(jiàn)的惡性腫瘤，超過(guò)90%的口腔癌病理類型是口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)，盡管近幾十年來(lái)在手術(shù)、放療、化療等方面取得了巨大進(jìn)展，但口腔癌患者的5年生存率未見(jiàn)明顯改善[1]。癌細(xì)胞往往對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致化療的失敗[2]。因此提高口腔癌的治療水平，尤其是尋找安全有效的抗口腔癌藥物輔助抗癌至關(guān)重要。沒(méi)食子酸(gallic acid, GA)又被稱作五倍子酸，有研究表明，沒(méi)食子酸能夠抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]，但是沒(méi)食子酸能否誘導(dǎo)OSCC發(fā)生自噬及其作用機(jī)制尚不明確。本研究采用體外實(shí)驗(yàn)探討沒(méi)食子酸通過(guò)誘導(dǎo)OSCC自噬作用抑制口腔癌，初步探討其抑制PI3K/Akt/mTOR通路的作用機(jī)制，為沒(méi)食子酸作為抗口腔癌輔助藥物的臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人舌鱗癌細(xì)胞系SCC15(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司購(gòu)買)。

1.2 試劑和抗體

沒(méi)食子酸和MDC染色試劑盒購(gòu)自凱基公司；MTT購(gòu)自Solarbio公司；p-Akt抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；p-mTOR多克隆抗體、Beclin 1多克隆抗體、LC3BⅠ/Ⅱ多克隆抗體購(gòu)自萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

醫(yī)用超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫孵育箱購(gòu)自美國(guó)Queue System公司；生物倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；伯樂(lè)Bio-rad垂直電泳系統(tǒng)購(gòu)自BIO-RAD Laboratories。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人舌鱗癌細(xì)胞系SCC15(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供)細(xì)胞置于含10% FBS、100 U/mL青-鏈霉素混合液的DMEM/F12培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 MTT實(shí)驗(yàn) 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SCC15細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1.0×104個(gè)/孔，培養(yǎng) 24 h。待細(xì)胞貼壁后分別加入0、30、60、90、120、150、300、600 μmol/L的沒(méi)食子酸100 μL，每組分設(shè)4個(gè)復(fù)孔。然后置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48 h。MTT檢測(cè)前，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液孵育4 h，棄去上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，結(jié)晶充分溶解后，酶聯(lián)檢測(cè)儀的波長(zhǎng)調(diào)整為490 nm，檢測(cè)每孔的光密度值(OD值)，然后計(jì)算SCC15細(xì)胞增殖率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.4.3 MDC染色法 分組將SCC15細(xì)胞于24孔板內(nèi)爬片至所需要的密度，加藥(0、150、300 μmol/L沒(méi)食子酸)處理48 h；每孔加入100 μL MDC染色工作液(以 1×Wash Buffer：MDC染色液體積比=9∶1 稀釋染色液至工作濃度)，室溫避光染色20 min 后，棄去染色液，以1×Wash Buffer，300 μL 洗3次，以防淬滅封片劑封片后，熒光顯微鏡拍照。

1.4.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)通路蛋白 SCC15細(xì)胞加入0、150、300 μmol/L沒(méi)食子酸培養(yǎng)48 h后，PBS清洗3遍后，加入RIPA裂解液(含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min；將液體移入EP管中，置于高速低溫離心機(jī)中，12 000 r/min、4 ℃、10 min，吸出上清液，BCA方法測(cè)定蛋白濃度。取20 μL 蛋白上樣跑電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，等滲緩沖鹽溶液(TBST)洗膜10 min×3次，二抗室溫孵育至少1 h，TBST洗膜10 min×3次，化學(xué)發(fā)光顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞增殖的影響

沒(méi)食子酸的濃度分別為30、60、90、120、150、300、600 μmol/L作用SCC15細(xì)胞24 h后，SCC15細(xì)胞增殖的抑制率分別為(1.40±2.80)%、(2.48±2.25)%、(11.83±5.16)%、(20.15±8.91)%、(31.47±2.13)%、(41.09±0.79)%、(59.21±2.61)%，IC50=421.6 μmol/L；作用48 h后，SCC15細(xì)胞增殖的抑制率分別為(5.70±7.13)%、(11.44±5.40)%、(19.96±11.61)%、(32.41±2.07)%、(41.48±1.27)%、(55.54±2.82)%、(71.93±6.67)%，IC50=273.8 μmol/L，結(jié)果見(jiàn)圖1。90、120、150、300、600 μmol/L沒(méi)食子酸作用于SCC15細(xì)胞24、48 h后，SCC15細(xì)胞抑制率與空白對(duì)照組相比顯著增加(P<0.05)，且有一定的劑量依賴關(guān)系。

與對(duì)照組比較，#表示24 h抑制率P<0.05；*表示48 h抑制率P<0.05圖1 不同濃度的GA作用SCC15細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of SCC15 cells at various time points after treatment with GA under various concentrations

2.2 MDC染色法檢測(cè)沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞自噬體形成的影響

0、150、300 μmol/L的沒(méi)食子酸分別作用于SCC15細(xì)胞48 h之后，MDC檢測(cè)結(jié)果顯示，150 μmol/L沒(méi)食子酸組：細(xì)胞中散布于細(xì)胞質(zhì)及核周的點(diǎn)狀熒光顆粒(即自噬體)增多不是很明顯；300 μmol/L沒(méi)食子酸組：細(xì)胞中散布于細(xì)胞質(zhì)及核周的點(diǎn)狀熒光顆粒顯著增多。結(jié)果如圖2所示。

圖中白色箭頭，標(biāo)記散布于細(xì)胞質(zhì)及核周的染有MDC熒光的自噬體呈點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)圖2 不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞自噬體形成的影響( ×400)Fig.2 Effect of different concentrations of GA on autophagosome formation in SCC15 cells ( ×400)

2.3 Western blot檢測(cè)沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞增殖及自噬蛋白表達(dá)的影響

0、150、300 μmol/L的沒(méi)食子酸分別作用于SCC15細(xì)胞48 h之后，Western blot分析顯示，與對(duì)照組相比較，p-Akt蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。p-mTOR蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比較，細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖5所示。沒(méi)食子酸還促進(jìn)了SCC15細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，使LC3Ⅱ的表達(dá)顯著性增加(P<0.05)，如圖6。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05圖3 不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of p-Akt in SCC15

*：與對(duì)照組比較，P<0.05圖4 不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞p-mTOR蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of p-mTOR in SCC15

*：與對(duì)照組比較，P<0.05圖5 不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of Beclin1 in SCC15

*：與對(duì)照組相比，P<0.05圖6 不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of different concentrations of GA on the protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰin SCC15

3 討 論

2018年全球范圍內(nèi)口腔癌新發(fā)病例354 864人次，死亡病例177 384人次，死亡率在常見(jiàn)癌癥中位于第14位[4]。在我國(guó)口腔癌的預(yù)防和治療仍然是一個(gè)重要的難題，尋找行之有效的輔助治療藥物是我們當(dāng)今階段迫切需要解決的問(wèn)題。臨床上預(yù)防治療口腔癌理想的化學(xué)藥物應(yīng)具有無(wú)毒或毒副作用很小、可口服、高效、作用機(jī)制明確、人們易于接受、價(jià)格低廉等特征。天然提取物有取材豐富、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[5-7]。

沒(méi)食子酸是一種天然多酚類化合物，在自然界廣泛存在，如水果、茶葉等植物中。利用小鼠做沒(méi)食子酸的急性毒性試驗(yàn)，當(dāng)沒(méi)食子酸的攝入濃度達(dá)到5 g/kg體質(zhì)量時(shí)，仍然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)小鼠有死亡或者急性中毒的現(xiàn)象[8]。本研究中應(yīng)用MTT的方法檢測(cè)沒(méi)食子酸對(duì)SCC15細(xì)胞增殖的抑制率，發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸達(dá)到一定濃度時(shí)對(duì)SCC15細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸降低了SCC4的細(xì)胞活性、誘導(dǎo)SCC4的DNA損傷，且存在劑量依賴性關(guān)系[9]，這與本研究的結(jié)果一致。Lu等研究發(fā)現(xiàn)，沒(méi)食子酸可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體凋亡和激活A(yù)TM-JNK(c-Jun基末端激酶)信號(hào)通路，促進(jìn)OSCC的細(xì)胞凋亡[10]，但沒(méi)食子酸對(duì)自噬作用的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

MDC是一種相對(duì)特異性自噬標(biāo)記物，它可被細(xì)胞吸收并選擇性地聚集于自噬體中[11]。通過(guò)顯微鏡可觀察到染有MDC熒光的自噬體呈點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，散布于細(xì)胞質(zhì)及核周，因此可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的變化來(lái)推斷自噬的活化。本研究MDC染色結(jié)果顯示，300 μmol/L沒(méi)食子酸組細(xì)胞中散布于細(xì)胞質(zhì)及核周的點(diǎn)狀熒光顆粒顯著增多，提示沒(méi)食子酸可以誘導(dǎo)SCC15細(xì)胞發(fā)生自噬。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞自噬與增殖的主要調(diào)節(jié)通路[12-15]，Akt與mTOR是這條通路上重要的介導(dǎo)分子，Akt的磷酸化(即p-Akt)是PI3K/Akt通路激活的檢測(cè)指標(biāo)。mTOR是自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，p-mTOR是其被激活后的磷酸化形式，進(jìn)而影響下游的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)[16]。Beclin1是自噬的核心調(diào)節(jié)因子；在自噬體形成過(guò)程中，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，與自噬體的形成密切相關(guān)[17]。Western blot分析顯示，150、300 μmol/L的沒(méi)食子酸可以降低p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)；細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)明顯增加；沒(méi)食子酸還促進(jìn)了SCC15細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，使LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)顯著性增加。沒(méi)食子酸可誘導(dǎo)SCC15細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路，進(jìn)而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)有關(guān)。

沒(méi)食子酸的提取工藝相對(duì)簡(jiǎn)單；可以口服，生物利用度高[18]；對(duì)多種腫瘤有較強(qiáng)的殺傷作用，且對(duì)于正常和健康的細(xì)胞毒副作用較低[19-20]，能為廣大患者所接受。本研究探討沒(méi)食子酸對(duì)人舌鱗癌SCC15細(xì)胞增殖及自噬作用的影響及其可能的作用機(jī)制，為沒(méi)食子酸今后作為口腔癌化學(xué)預(yù)防和放化療輔助用藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。