高澤汝，寧夢(mèng)茹，劉昆侖，陳復(fù)生

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

高血壓可導(dǎo)致許多嚴(yán)重疾病，包括心肌梗死、腦出血、腎衰竭和中風(fēng)等，已成為危害人類(lèi)生命的“無(wú)形殺手”，當(dāng)前世界上的高血壓人數(shù)已超過(guò)10億[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)是一種鋅金屬肽酶，同時(shí)顯示內(nèi)肽酶和外肽酶兩種特性，可作用多種底物，主要通過(guò)兩種途徑引起血壓的上升：(1)催化腎素-血管緊張素系統(tǒng)，生成一種強(qiáng)有效的血管收縮劑——血管緊張素Ⅱ；(2)影響激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，促使緩激肽催化功能的減弱與失活[2]。因此，ACE抑制劑常作為一線藥物對(duì)高血壓進(jìn)行預(yù)防及控制。食源性ACE抑制肽由于天然健康、安全有效、低毒副作用成了研究者的關(guān)注焦點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從核桃、葵花籽、花生、鷹嘴豆、西蘭花等多種物質(zhì)中分離獲得ACE抑制肽[3-7]。

玉米胚芽是玉米籽粒的“生命之源”，脂肪、蛋白和灰分含量較高，其中玉米胚芽蛋白含有全部的必需氨基酸，是植物蛋白的極佳來(lái)源，但未得到很好的開(kāi)發(fā)利用[8]。玉米胚芽蛋白酶解物，特別是小分子量的組分，具有調(diào)節(jié)和預(yù)防某些疾病的生理特性，可作為抗高血壓和抗氧化劑[9]。Parris等[10]選用4種酶酶解玉米胚芽蛋白，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ACE抑制肽分子質(zhì)量小于1 kDa；Zhang等[11]從玉米胚芽蛋白中分離出3種抗氧化肽，具有較高的自由基清除、氧自由基吸收等抗氧化能力。

作者以玉米胚芽為原料，酶法制備玉米胚芽ACE抑制肽，探究蛋白酶種類(lèi)及酶解工藝對(duì)ACE抑制率的影響，并采用響應(yīng)面法明確最佳制備工藝，以期為ACE抑制肽的醫(yī)學(xué)應(yīng)用及功能性食品的發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米胚芽：山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司；堿性蛋白酶(200 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(20 U/mg)、胃蛋白酶(30 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)：上海源葉生物科技有限公司； N- [3-(2-呋喃基)丙烯?；鵠-Phe-雙甘氨酸(N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)：美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司； JJ-6六聯(lián)電動(dòng)攪拌器：常州普天儀器制造有限公司；GL-10000 C高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博運(yùn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TECAN酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

使用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎玉米胚芽，以料液比1∶6(g/mL)加入正己烷振蕩脫脂，重復(fù)3次，置于通風(fēng)櫥晾干，過(guò)100目篩，密封于-20 ℃干燥避光處保存，備用。

1.3.2 玉米胚芽ACE抑制肽的制備工藝

玉米胚芽脫脂粉→加入去離子水(料液比1∶15，g/mL)→調(diào)節(jié)pH值至9.5(1 mol/L NaOH)→連續(xù)攪拌120 min(50 ℃恒溫)→離心30 min(4 000 r/min)→調(diào)節(jié)上清液pH值至4.8(1 mol/L HCl)→靜置20 min→離心15 min(5 000 r/min)→沉淀洗至中性→冷凍干燥→玉米胚芽蛋白。

玉米胚芽蛋白→加入去離子水(控制一定底物濃度)→調(diào)節(jié)pH值(1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl)→加酶→90 ℃滅酶(10 min)→冷凍離心20 min(10 000 r/min)→收集上清液→冷凍干燥。

1.3.3 酶解產(chǎn)物水解度的測(cè)定

水解度(DH)的測(cè)定采用茚三酮比色法[12]。

1.3.4 ACE抑制率的測(cè)定

采用FAPGG法體外測(cè)定ACE抑制率[13]。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

不同蛋白酶對(duì)玉米胚芽蛋白的酶解工藝參數(shù)如表1所示。以酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率為考察指標(biāo)，確定后續(xù)試驗(yàn)用酶。在此基礎(chǔ)上，考察pH值(5、6、7、8、9)、底物濃度(1%、3%、5%、7%、9%)、加酶量(2 000、4 000、8 000、12 000、16 000 U/g)和溫度(30、40、45、50、60 ℃)對(duì)酶解產(chǎn)物DH和ACE抑制率的影響。

表1 不同蛋白酶的酶解工藝參數(shù)Table 1 Parameters of enzymatic hydrolysis of different proteases

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH值(X1)、加酶量(X2)、溫度(X3)為優(yōu)化變量，以酶解產(chǎn)物ACE抑制率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定酶解玉米胚芽蛋白的最優(yōu)工藝條件。響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次。采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果分析及預(yù)測(cè)。采用SPSS Statistics 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同蛋白酶對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響

由于不同蛋白酶作用底物的結(jié)合位點(diǎn)及水解方式不同，其酶解片段的結(jié)構(gòu)與活性亦不相同，因此，選取合適的蛋白酶是制備目標(biāo)肽的重要因素[14]。由圖1可知，不同蛋白酶的水解效果差異顯著，水解度由高到低依次為風(fēng)味蛋白酶>堿性蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶；風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高，明顯高于其他蛋白酶。說(shuō)明玉米胚芽蛋白結(jié)構(gòu)更適宜風(fēng)味酶發(fā)揮作用，能夠有效釋放更多目標(biāo)肽段。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水解產(chǎn)物的水解度和ACE抑制率呈現(xiàn)不斷增高后趨于平緩的趨勢(shì)。因此選擇風(fēng)味酶為后續(xù)試驗(yàn)用酶，且控制酶解時(shí)間為120 min。

圖1 不同蛋白酶對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響Fig.1 Effects of different proteases on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

2.1.2 pH值對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響

由圖2可知，隨著pH值的不斷增加，水解度和ACE抑制率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)。在pH 6時(shí)，水解度和ACE抑制率均達(dá)到最大值，當(dāng)繼續(xù)增大pH值，水解度和ACE抑制率均不斷降低。這可能是因?yàn)閜H值超出一定范圍影響了蛋白酶的穩(wěn)定性，同時(shí)底物與蛋白酶的電荷分布發(fā)生變化，降低了酶與底物的結(jié)合能力，進(jìn)而影響酶解進(jìn)程。因此，可初步確定風(fēng)味酶最佳酶解為pH 6。

2.1.3 底物濃度對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響

由圖3可知，隨著底物濃度的不斷增大，水解度和ACE抑制率總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，二者均達(dá)到最高值，分別為(28.17±0.44)%和(56.11±2.07)%。原因可能是當(dāng)?shù)孜餄舛瘸鲎钸m范圍，酶解液中溶質(zhì)的流動(dòng)性變差，使反應(yīng)過(guò)程中蛋白酶的擴(kuò)散作用降低，從而導(dǎo)致了水解反應(yīng)的速率降低。因此，較為合適的底物濃度為3%。

圖2 pH值對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of pH value on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

圖3 底物濃度對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

2.1.4 加酶量對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響

圖4 加酶量對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

如圖4可知，水解度和ACE抑制率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)快速升高的趨勢(shì)。這是由于加酶量的增加提供了更多反應(yīng)位點(diǎn)，提高了酶的作用效率，釋放了更多的活性肽段。當(dāng)加酶量超過(guò)一定值，ACE抑制率反而下降。原因是水解反應(yīng)過(guò)度，使原本具有活性的多肽活性喪失，生成較多游離的氨基酸。因此，加酶量要控制適當(dāng)，較為合適的加酶量為12 000 U/g。

2.1.5 溫度對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響

由圖5可知，水解度和ACE抑制率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最高值(65.73±0.21)%，但繼續(xù)升高溫度，ACE抑制率快速下降。說(shuō)明蛋白酶對(duì)溫度的變化較為敏感，溫度過(guò)低不利于反應(yīng)的充分發(fā)生，而溫度過(guò)高則會(huì)引起酶部分失活。因此，選擇酶解溫度為45 ℃。

圖5 溫度對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on DH and ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取風(fēng)味蛋白酶酶解玉米胚芽蛋白，固定底物濃度為3%，酶解時(shí)間為120 min，根據(jù)響應(yīng)面法的Box-Benhnken原理，選取pH值、加酶量和溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface experiment design and results

表4 回歸模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，得到各因素?cái)M合后的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=68.67-13.21X1+5.71X2-5.96X3+2.73X1X3-3.5X12-8.62X22-4.53X32。由表4可知，回歸模型極顯著(P<0.000 1)，R2=0.986 4，說(shuō)明該模型置信度高，ACE抑制率與各因素之間線性關(guān)系顯著。因此，可通過(guò)上述方程確定此酶解工藝的最優(yōu)參數(shù)。此外，通過(guò)F檢驗(yàn)值可知3個(gè)因素對(duì)ACE抑制率的影響大小依次為X1(pH值)>X3(溫度)>X2(加酶量)。圖6是加酶量為零水平(12 000 U/g)時(shí)，pH值和溫度的響應(yīng)面圖。當(dāng)加酶量確定時(shí)，pH值與溫度的交互作用對(duì)ACE抑制率影響顯著，而pH值和加酶量、加酶量和溫度的交互作用對(duì)ACE抑制率影響不顯著。

圖6 pH值和溫度的交互作用對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制率的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface diagram of the interaction of various factors on ACE inhibition rate of hydrolysates of maize germ protein

通過(guò) Design-Expert 8.0.6軟件分析及預(yù)測(cè)，得到最優(yōu)酶解工藝參數(shù)：pH 6，溫度40 ℃，加酶量13 300 U/g。采用此最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證，將酶解參數(shù)設(shè)定為底物濃度3%、酶解時(shí)間120 min、pH 6，溫度40 ℃，加酶量13 300 U/g，酶解產(chǎn)物的實(shí)際ACE抑制率為(85.64±0.98)%，接近預(yù)測(cè)值83.49%，說(shuō)明該回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)不同蛋白酶對(duì)玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率的比較，發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高，通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到影響ACE抑制率的3個(gè)因素由主到次依次為pH值、溫度和加酶量，確定最優(yōu)酶解工藝條件：底物濃度3%，酶解時(shí)間120 min，pH 6，溫度40 ℃，加酶量13 300 U/g，此時(shí)ACE抑制率為(85.64±0.98)%，與預(yù)測(cè)值吻合。玉米胚芽蛋白酶解產(chǎn)物具有顯著的ACE抑制活性，可為降血壓藥物及相關(guān)功能性食品等諸多領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。