林大成，張玲玲，張自然，譚柳思

1.北部灣大學(xué) 食品工程學(xué)院,廣西 欽州 535011 2.北部灣大學(xué) 廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 欽州 535011 3.北部灣大學(xué) 欽州市特色果蔬發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 欽州 535011

隨著國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展水平的提高，人們對食品的質(zhì)量要求越來越高，食品防腐保鮮成為重要的研究課題之一。生物防腐劑取代化學(xué)防腐劑是目前與未來食品質(zhì)量保鮮的發(fā)展趨勢。為了開發(fā)食品保鮮劑，近年來國內(nèi)外不少研究者對微生物在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了研究，其中乳酸菌保鮮相對于傳統(tǒng)的化學(xué)保鮮、低溫保鮮、輻照保鮮和氣調(diào)保鮮，具有安全、高效和低成本等特點(diǎn)[1]。目前，乳酸菌主要應(yīng)用于乳制品和蔬菜水果的保鮮，而很少應(yīng)用于水產(chǎn)品的保鮮。此外，乳酸菌保鮮多采用其乙醇提取物部分[2-3]，對剩余醇沉成分的功效卻鮮有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵過程中將糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸、胞外多糖、醇類甚至乳鏈球菌素(Nisin)和過氧化氫等物質(zhì)，這些物質(zhì)可有效抑制有害菌的繁殖，從而提高食品的保藏性能[4-5]。水產(chǎn)品易腐敗最難保鮮，其中鮮蠔營養(yǎng)豐富，素有水產(chǎn)牛奶之稱，而廣西欽州盛產(chǎn)鮮蠔，故可作為水產(chǎn)品保鮮試驗(yàn)的典型代表。

枸杞、紅景天及綠藻因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)如多糖、蛋白、多酚和黃酮類物質(zhì)，已引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。枸杞具有提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤等功能，其中的主要功效成分為枸杞多糖[6]。枸杞多糖多采用熱水浸提然后乙醇沉淀，或采用微生物發(fā)酵法提取[7]。紅景天具有抗氧化和抗疲勞等多種生理功能，其主要活性成分為紅景天苷與苷元酪醇[8-9]。綠藻主要活性成分為多糖與生物活性生長因子，具有抗氧化、增強(qiáng)人體免疫功能等功效[10]。由于目前生物保鮮劑的制備量偏少，效果不彰，應(yīng)用不廣，因此，企待創(chuàng)新方法，提升產(chǎn)量，彰顯效果，以因應(yīng)綠色食品的潮流趨勢。作者采用枸杞、紅景天和綠藻組成的中藥制劑促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵，以提升發(fā)酵液中醇沉組分(蛋白多糖)的提取量并強(qiáng)化其中活性成分的功能，以期為中藥優(yōu)化生物保鮮劑的制備與功能研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮蠔：欽州市海華蠔業(yè)科技開發(fā)有限公司；中藥制劑(枸杞、紅景天、綠藻)：臺灣中藥廠與食品公司；混合乳酸菌種(嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌)：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司。1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH, Sigma)：西安熱默爾生物科技有限公司；95%乙醇、抗壞血酸、苯酚、葡萄糖、沒食子酸和Folin-Ciocalteau 試劑等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Evolution 201 & 220紫外-可見光分光光度計(jì)：上海譜祥科學(xué)儀器有限公司；TG16 MW臺式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；KTNK-80冷凍干燥機(jī)：上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以MRS培養(yǎng)基添加經(jīng)蒸煮提煉的中藥濃縮液(1%，V山藥∶V枸杞∶V紅景天=1∶1∶1)培養(yǎng)混合乳酸菌(1%，V嗜酸乳桿菌∶V德氏乳桿菌保加利亞亞種∶V嗜熱鏈球菌=1∶1∶1)作為試驗(yàn)組(EX)，以不添加中藥僅加乳酸菌發(fā)酵為控制組(CL)和單純鮮蠔汁為對照組(BK)進(jìn)行抗氧化功能評估。抗氧化功能以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)，并測定總酚含量，以闡述抗氧化的機(jī)理。

1.4 有效成分的提取與分析

將EX與CL兩組試驗(yàn)的發(fā)酵液靜置于冰箱3 h后，離心(6 000g，15 min)，取沉淀物于烘箱中烘干(105 ℃，72 h)，恒質(zhì)量后即得菌體質(zhì)量。離心后的上清液經(jīng)減壓濃縮至1/3體積后加入3倍等體積的乙醇(95%)，4 ℃靜置24 h，取沉淀物，冷凍干燥，即得粗醇沉組分(Ethanol precipitated component，EPC)，稱質(zhì)量得EPC產(chǎn)量；EPC產(chǎn)率為EPC干質(zhì)量與菌體干質(zhì)量的比值。進(jìn)一步將所得粗EPC經(jīng)3次循環(huán)的分子質(zhì)量(18～20 kD)透析純化，冷凍干燥得純EPC。并經(jīng)巴氏滅菌法(65 ℃, 30 min)滅酶殺菌，再利用酸水解純EPC并分別測定水解前后蛋白質(zhì)和多糖含量及純EPC質(zhì)量，純EPC組成為背景組(BG)。同法進(jìn)行純鮮蠔汁的測定作為對照組(BK)。蛋白質(zhì)和多糖的總回收率：[(蛋白質(zhì)+多糖)/純EPC]×100%。純EPC的回收率：(純EPC/粗EPC)×100%。蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)法[11]，多糖測定采用總糖苯酚硫酸法[12]。

1.5 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)主要考察中藥添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、菌種添加量(6%、8%、10%、12%、14%) 及發(fā)酵時(shí)間(4、6、8、10、12 h)對EPC產(chǎn)量的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以EPC產(chǎn)量為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平L9(33)的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

1.6 抗氧化試驗(yàn)

所有試驗(yàn)所用EPC質(zhì)量濃度均為10 mg/mL，對EPC抗氧化能力的評估主要是測定DPPH自由基清除能力與總酚含量。DPPH清除能力測定：參考文獻(xiàn)[13]的方法?？偡雍繙y定：采用Folin-Ciocalteu法，參考Gao等[14]的方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用Duncan法(P<0.05)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇沉組分制備單因素試驗(yàn)

2.1.1 中藥添加量對醇沉組分產(chǎn)量的影響

中藥添加量對EPC產(chǎn)量的影響如圖1(a)所示。隨著中藥添加量的增加，EPC的產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)中藥添加量為3%時(shí)，EPC的產(chǎn)量最高，為(986±13) mg/L，與其他添加量的產(chǎn)量相比具有顯著差異(P<0.05)，此時(shí)乳酸菌的生長最穩(wěn)定，發(fā)酵作用最旺盛，最適合EPC的生產(chǎn)。當(dāng)中藥添加量高于3%時(shí)，底物抑制現(xiàn)象將不利于乳酸菌的生長繁殖，從而造成發(fā)酵液中EPC含量降低，故最適中藥添加量為3%左右。中藥的添加可影響乳酸菌的發(fā)酵作用，提供發(fā)酵生產(chǎn)EPC的刺激因子，強(qiáng)化乳酸菌的生長并激發(fā)酶類的生化反應(yīng)[10]。林大成等[13]研究發(fā)現(xiàn)，中草藥(紅曲、山藥和蘆薈，1.0%)的添加對乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中胞外多糖的產(chǎn)量和產(chǎn)率均有促進(jìn)作用。

2.1.2 菌種添加量對醇沉組分產(chǎn)量的影響

菌種添加量對EPC產(chǎn)量的影響如圖1(b)所示。菌種添加量為6%～12%時(shí),添加量與EPC產(chǎn)量呈正相關(guān)。開始階段，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，接種量越大，代謝產(chǎn)物含量越高，越有利于中藥制劑的多糖等醇沉組分的溶出，即菌種添加量的增加有利于EPC的生產(chǎn)；但當(dāng)菌種量超過12%時(shí)，則會出現(xiàn)微生物量過多而導(dǎo)致底物不足，一部分菌體在競爭中死亡，從而造成EPC產(chǎn)量降低，故最適菌種添加量為12%左右，此時(shí)產(chǎn)量最高，為(982±13) mg/L,與其他添加量的產(chǎn)量相比具有顯著差異(P<0.05)。鄭苗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加懷山藥的乳酸菌發(fā)酵液中主要產(chǎn)物乳酸隨著接種量的增加呈現(xiàn)先上升而后平穩(wěn)的趨勢。因此，本研究中當(dāng)菌種量超過12%時(shí)，隨著菌種競爭使代謝產(chǎn)酸能力下降，蛋白和多糖等醇沉組分的溶出也隨之減少；另外在底物不足時(shí)，中草藥中的一些刺激因子也隨之減少，降低乳酸菌多糖等醇沉組分的生成，從而導(dǎo)致最終EPC產(chǎn)量降低,此先上升后下降的變化趨勢與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的一致。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對醇沉組分產(chǎn)量的影響

發(fā)酵液中EPC的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間延長呈先增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢，如圖1(c)所示。4～10 h內(nèi)發(fā)酵液的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，乳酸菌快速生長，產(chǎn)生大量的乳酸和酶類，乳酸促使中藥中的蛋白質(zhì)、多糖以及多酚等活性成分不斷溶出，導(dǎo)致EPC產(chǎn)量快速增加；10 h后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，乳酸增加速度減慢，蛋白、多糖等成分的溶出也隨之減少；而乳酸菌數(shù)量的增加造成溶出的碳源和氮源被迅速分解，導(dǎo)致發(fā)酵液中EPC的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定[16]。故從經(jīng)濟(jì)性考慮，最適發(fā)酵時(shí)間為10 h左右，此時(shí)EPC產(chǎn)量最高，為(889±19) mg/L, 除12 h外與其他發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)量相比具有顯著差異(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)添加枸杞、紅景天等中藥的乳酸菌發(fā)酵液中含有酶類(胞內(nèi)酶和胞外酶)、粗多糖、蛋白質(zhì)及總酚類成分[17-18]。

2.2 醇沉組分制備的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。各因素對EPC產(chǎn)量影響的順序?yàn)锳>C>B，即中藥添加量對EPC產(chǎn)量影響最大，發(fā)酵時(shí)間次之，菌種添加量的影響最小。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥工藝研究也證實(shí)發(fā)酵時(shí)間對代謝產(chǎn)物的影響大于接種量[15]。最優(yōu)組合為A2B3C3，即中藥添加量3%，菌種添加量14%，發(fā)酵時(shí)間12 h。適當(dāng)?shù)木N添加量可稍微促進(jìn)乳酸菌EPC的生產(chǎn)，充足的發(fā)酵時(shí)間比菌種添加量更能促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生EPC，適當(dāng)?shù)闹兴幪砑恿靠蓮?qiáng)化促進(jìn)乳酸菌生產(chǎn)EPC[19]，但過量的中藥則會抑制EPC的生產(chǎn)。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

因正交試驗(yàn)最優(yōu)組合不在正交試驗(yàn)表中，故進(jìn)行驗(yàn)證和對比試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。中藥制劑發(fā)酵液中EPC產(chǎn)量為(1 188±35) mg/L，與正交試驗(yàn)第5組的結(jié)果大致符合，證明該正交試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。添加中藥的試驗(yàn)組與不添加中藥的控制組、純新鮮蠔汁的對照組相比，具有顯著較高的EPC產(chǎn)量及產(chǎn)率(P<0.05)。EPC產(chǎn)量與產(chǎn)率的高低為試驗(yàn)組>控制組>對照組，此現(xiàn)象顯示乳酸菌的生長量與EPC產(chǎn)量及產(chǎn)率呈正相關(guān)，可初步說明試驗(yàn)所用中藥制劑對EPC產(chǎn)量有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6, 8, 20]。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天和輪葉黨參混合提取物可促進(jìn)乳酸菌的生長，并提高發(fā)酵液蛋白質(zhì)、多糖和多酚的含量[8]。枸杞提取物也可促進(jìn)微生物發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量[20]。

表2 驗(yàn)證與對比試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Verification and comparison test results

2.4 醇沉組分中主要活性成分分析

目前利用微生物發(fā)酵制得的綠色生物產(chǎn)品，已有作為抗氧化保健食品與蔬菜抗病毒預(yù)防的應(yīng)用報(bào)道，研究其活性成分為蛋白多糖[21-22]。將本研究的粗EPC再進(jìn)一步透析純化，所得約90.5%純EPC并分析其主要組成，如表3所示，純蛋白多糖中蛋白質(zhì)和多糖總和的回收率90.2%～92.5%；而蛋白質(zhì)與多糖分別占純蛋白多糖的比例為11.4%～12.2%與78.6%～79.3%，其中蛋白質(zhì)含量與王賀等[12]的研究結(jié)果類似。王賀等以Sevag法除去蛋白質(zhì)和本研究經(jīng)巴氏滅菌法滅酶鈍化處理，二者成分皆無活性功能,因此，推斷EPC中蛋白質(zhì)可能為非主要活性成分[12]。

表3 蛋白多糖中的主要活性成分Table 3 Main active components in proteoglycan

由表3可知，試驗(yàn)組(EX)的蛋白質(zhì)、多糖含量、純蛋白多糖及總酚含量都顯著高于控制組(CL)和對照組(BK)(P<0.05)?？芍囼?yàn)組的中藥乳酸菌配方組合較能提高EPC的產(chǎn)量，效果優(yōu)于未添加中藥乳酸菌的控制組。比較背景組(BG)與試驗(yàn)組酸水解EPC前后的組成,顯示純EPC質(zhì)量與總酚含量二者并無顯著差異(P>0.05)，可知醇沉組分EPC由蛋白質(zhì)與多糖共價(jià)構(gòu)成的蛋白多糖(proteoglycan, PG)或多糖蛋白(Glycoprotein, GP)[12,16]。圖2為蛋白多糖質(zhì)量濃度對總酚含量和DPPH自由基清除率的影響，表3與圖2顯示總酚含量與蛋白多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且DPPH自由基清除能力也隨蛋白多糖質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng);而純EPC中蛋白活性已經(jīng)巴氏殺菌法滅酶鈍化[12,19]，故可初步推斷EPC是以蛋白修飾多糖為主體的蛋白多糖，而非以多糖修飾蛋白為主體的多糖蛋白。

圖2 蛋白多糖質(zhì)量濃度對總酚含量和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of proteoglycan mass concentration on TPC and DPPH scavenging capacity

2.5 中藥優(yōu)化蛋白多糖的活性分析

由圖2可知，多酚含量與DPPH自由基清除能力隨蛋白多糖質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)；且總酚含量與抗氧化活性呈正相關(guān)，此與朱秀靈等[23]的研究結(jié)果符合。另外王麗霞等[24]以Sevag法除去山藥蛋白多糖體的游離蛋白質(zhì)，得到結(jié)合蛋白質(zhì)含量為13.98%，與本研究的蛋白多糖含量相當(dāng)；而其體外抗氧化能力與蛋白多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，也與本研究結(jié)果相符。綜合文獻(xiàn)結(jié)果，前人研究胞外多糖中蛋白質(zhì)與多糖比例分別為2.2%～10.71%與68.1%～78.56%[25-26]。本研究的純蛋白多糖中二者比例分別為11.4%～12.2%與78.6%～79.3%，皆高于前人的研究；而前人研究胞外多糖質(zhì)量濃度在5～40 mg/mL時(shí)對DPPH自由基清除率為6.50%～75.0%，此時(shí)總酚含量為0.52～18.96 mg/g[27-28]。本研究純蛋白多糖質(zhì)量濃度在2～10 mg/mL時(shí)對DPPH自由基清除率為27%～83%，此時(shí)總酚含量為3.5～26.7 mg/g，也皆優(yōu)于前人的研究結(jié)果。因此推論中藥特殊成分可激活乳酸菌發(fā)酵生化反應(yīng)中的酶系統(tǒng),使原共價(jià)結(jié)合酚釋出可溶性結(jié)合酚而增加總酚含量[29-30]，因而表現(xiàn)出較高的DPPH自由基清除率。故說明本研究以中藥優(yōu)化生物保鮮劑的活性成分具有顯著效果。

3 結(jié)論

本研究利用中藥促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)EPC，以優(yōu)化生物保鮮劑的制備工藝并分析其活性成分，顯示最佳的EPC發(fā)酵工藝制備條件為中藥添加量3%、菌種添加量14%、發(fā)酵時(shí)間12 h，此時(shí)EPC產(chǎn)量和產(chǎn)率最高，分別為(1 188±35)mg/L與(46.6±1.3)%。當(dāng)EPC質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其多酚含量為(26.2±0.6) mg/g, 對DPPH自由基清除率可達(dá)(83.0±3.0)%。由于EPC主要活性成分為含多酚的蛋白多糖,且DPPH自由基清除能力隨其質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，因此，初步推論EPC為含蛋白修飾的蛋白多糖。本研究的中藥制劑可優(yōu)化制備工藝，促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)生新穎優(yōu)異的蛋白多糖，具有應(yīng)用于水產(chǎn)食品保鮮的潛力。