付少偉，謝巖黎，班 珺

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450001

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是由黃曲霉、特曲霉以及寄生曲霉等產(chǎn)生的一類含有二氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物[1]，其中黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)因具有致癌性、致毒性和致突變性[2-4]，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為人類第一類致癌物[5-7]。黃曲霉毒素B1主要分布在大米、花生、玉米、小麥和大豆等農(nóng)作物中，污染可發(fā)生在生長(zhǎng)、收獲、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等多個(gè)環(huán)節(jié)[8]。我國(guó)規(guī)定人食用的玉米及其制品中AFB1含量不能超過20 μg/kg，小麥、大麥等其他谷物中AFB1含量不能超過5 μg/kg[9]，歐盟規(guī)定谷物及其制品、花生、堅(jiān)果及其加工制品中AFB1含量不能超過20 μg/kg[10]。

長(zhǎng)期以來，科研工作者為AFB1的檢測(cè)探索了許多方法，如薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)、膠體金免疫層析技術(shù)(Immune colloidal gold technique，GICT)、液質(zhì)聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)[9,11-12]。高效液相色譜法是檢測(cè)真菌毒素最常用的檢測(cè)技術(shù)，以液體作為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。Rodriguez-carrasco等[13]通過建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶樣品中黃曲霉毒素的含量，結(jié)果顯示該方法檢測(cè)限和定量限分別為0.001、0.002 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7%，在0.005、0.01、0.05 μg/L的加標(biāo)水平下，回收率為75%～96%。王督等[14]利用高效液相色譜對(duì)不同激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)、流動(dòng)相等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為360、440 nm，流動(dòng)相為水-甲醇(體積比為65∶35)時(shí)玉米中黃曲霉毒素檢測(cè)分離效果最佳。高效液相色譜法檢出限低、重現(xiàn)性好、靈敏度高，但凈化后的樣品需進(jìn)一步衍生，樣品預(yù)處理操作繁瑣、儀器昂貴、成本較高，不適合大批量檢測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[9]。

核酸適配體(核酸適體)1990年由Ellington等[15-16]提出，是采用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)[17]從體外人工合成的單鏈核酸文庫中篩選出與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合的寡核苷酸片段[18-19]，與抗體相比，適配體具有生產(chǎn)方便、成本低、熱穩(wěn)定好、易化學(xué)合成、易與多種官能團(tuán)修飾、高親和合力和高特異性等優(yōu)點(diǎn)[20-21]，在診斷、治療、檢測(cè)等領(lǐng)域成為重要工具,同時(shí)為生物毒素的分析檢測(cè)開辟了新道路?；谶m配體的以上優(yōu)點(diǎn)，作者將建立的酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與目前檢測(cè)AFB1最廣泛使用的高效液相色譜法進(jìn)行比較，對(duì)比檢出限、線性范圍、樣品回收率，分析適用情況，為探索黃曲霉毒素B1的快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃曲霉毒素B1(AFB1)：Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇(色譜純)：天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；氯化鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；高純氮(含量≥99.999%)：河南科益氣體工程有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；玉米、花生：市購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜、2475 HPLC FLR多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；光化學(xué)衍生器、黃曲霉毒素B1免疫親和柱：月旭材料科技(上海)有限公司；玻璃纖維濾紙：上海優(yōu)譽(yù)儀器儀表有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀(上海)有限公司；FW-80高速萬能粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；KQ100-E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DL-5-B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；MTN-2800D氮吹濃縮裝置：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶聯(lián)適體法檢測(cè)AFB1

參考Xie等[22]建立的酶聯(lián)適體法，用PBS結(jié)合緩沖液將AFB1母液稀釋成0、0.1、1、10、20、40、60、80、100 ng/mL，在優(yōu)化好的檢測(cè)體系中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。向酶標(biāo)板依次加入鏈霉親和素、牛血清蛋白、核酸適體(5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′)、核酸適體互補(bǔ)鏈(5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′)并充分反應(yīng)后，加入一系列不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)液，37 ℃溫育1 h使AFB1與AFB1核酸適體發(fā)生特異性緊密結(jié)合，從而迫使互補(bǔ)鏈從核酸適體上脫落。隨后甩干酶標(biāo)板并用PBST將脫落的互補(bǔ)鏈及過剩的AFB1洗脫，加入HRP-SA，37 ℃溫育1 h后分別加入TMB顯色，加入1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)法測(cè)A450/620，觀察不同濃度AFB1使檢測(cè)體系發(fā)生的顏色變化及A450/620變化，建立酶聯(lián)適體法檢測(cè)AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以20 mL乙腈-水(體積比為85∶15)為提取液，高速均質(zhì)5 min，4 000 r/min離心5 min后取4 mL上清液，氮吹儀吹干提取液，加入1 mL PBS工作液復(fù)溶，使待測(cè)液中AFB1質(zhì)量濃度分別為5、20、60 ng/mL。采用優(yōu)化好的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算回收率。

1.3.2 適體轉(zhuǎn)換熒光法檢測(cè)AFB1

參考班珺等[11]建立的適體轉(zhuǎn)換熒光法，以PBS為工作液，選擇最佳適體鏈，以Tris-HCl為工作液測(cè)定檢測(cè)系統(tǒng)的熒光恢復(fù)率。通過(F-F0)/F0求熒光增長(zhǎng)率，其中F0為猝滅狀態(tài)時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入毒素后的熒光強(qiáng)度。用PBS緩沖液將核酸適體(5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-FAM -3′)、猝滅鏈(5′-BHQ1-TGTGGGCCTAGCG-3′)配置成200 nmol/L，將AFB1母液稀釋成0、0.1、1、10、50、100、200、300 ng/L，在優(yōu)化好的檢測(cè)體系中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。400 μL 200 nmol/L核酸適體與400 μL 200 nmol/L猝滅鏈反應(yīng)30 min后，將800 μL一系列不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)液加入反應(yīng)體系，反應(yīng)1 h后測(cè)定熒光強(qiáng)度，以AFB1濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用優(yōu)化好的檢測(cè)方法測(cè)定樣品的初始濃度C0?；厥赵囼?yàn)中，向樣品分別加入5、20、60 μg/kg的AFB1，加標(biāo)后的檢測(cè)濃度為C1，以(C1-C0)/加標(biāo)濃度計(jì)算回收率。

1.3.3 高效液相色譜法檢測(cè)AFB1

參照LS/T 6128—2017《糧油檢驗(yàn) 糧食中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定超高效液相色譜法》配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行樣品提取及加標(biāo)，最后將樣品凈化后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法將酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測(cè)AFB1進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法檢測(cè)AFB1

采用高效液相色譜法檢測(cè)AFB1并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=1 135 950x-196 298.771 82(R2=0.999 6)，線性范圍為0.1～100 ng/mL，檢出限為0.1 ng/mL。采用高效液相色譜法對(duì)花生、玉米進(jìn)行AFB1的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表1和表2，花生中AFB1回收率為80.00%～92.40%，玉米中AFB1回收率為74.97%～102.05%。表明該方法可行，能抵抗其他常見高濃度生物毒素的干擾，效果良好。

表1 高效液相色譜法對(duì)花生中AFB1的測(cè)定Table 1 Determination of AFB1 in peanuts by HPLC

表2 高效液相色譜法對(duì)玉米中AFB1的測(cè)定Table 2 Determination of AFB1 in corns by HPLC

2.2 酶聯(lián)適體法檢測(cè)AFB1

采用酶聯(lián)適體法檢測(cè)AFB1并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=-0.01x+0.957 05(R2=0.990 1)，線性范圍為1～80 ng/mL，檢出限為0.7 ng/mL。采用酶聯(lián)適體法對(duì)花生、玉米進(jìn)行AFB1的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表3和表4，花生中AFB1回收率為85.40%～94.40%，玉米中AFB1回收率為81.00%～86.70%。表明該方法可行，能抵抗其他常見高濃度生物毒素的干擾，且效果良好。

表3 酶聯(lián)適體法對(duì)花生中AFB1的測(cè)定Table 3 Determination of AFB1 in peanuts by enzyme-linked aptamer method

表4 酶聯(lián)適體法對(duì)玉米中AFB1的測(cè)定Table 4 Determination of AFB1 in corns by enzyme-linked aptamer method

2.3 適體轉(zhuǎn)換熒光法檢測(cè)AFB1

采用適體轉(zhuǎn)換熒光法檢測(cè)AFB1并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=0.759 87x+148.928 30(R2=0.996 0)，線性范圍為1～300 ng/mL，檢出限為0.8 ng/mL。采用適體轉(zhuǎn)換熒光法對(duì)花生、玉米進(jìn)行AFB1的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表5和表6，花生中AFB1回收率為99.00%～108.33%，玉米中AFB1回收率為81.00%～85.56%。表明該方法可行，能抵抗其他常見高濃度生物毒素的干擾，效果良好。

表5 適體轉(zhuǎn)換熒光法對(duì)花生中AFB1的測(cè)定Table 5 Determination of AFB1 in peanuts by aptamer conversion fluorescence method

表6 適體轉(zhuǎn)換熒光法對(duì)玉米中AFB1的測(cè)定Table 6 Determination of AFB1 in corns by aptamer conversion fluorescence method

2.4 3種檢測(cè)方法的對(duì)比研究

酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測(cè)AFB1的對(duì)比結(jié)果如表7所示。3種檢測(cè)方法均呈現(xiàn)較好的回收率。從檢出限看，高效液相色譜法低于其他兩種檢測(cè)方法，說明作為精密儀器的高效液相色譜較其他兩種檢測(cè)方法靈敏度更好。從線性范圍看，核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換熒光法較高效液相色譜法更廣泛。對(duì)3種方法檢測(cè)30個(gè)樣品所需時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行對(duì)比，高效液相色譜法檢測(cè)1個(gè)樣品需40 min，總時(shí)約20 h，而基于核酸適體所建立的兩種檢測(cè)方法對(duì)30個(gè)樣品的檢測(cè)可同時(shí)進(jìn)行，時(shí)長(zhǎng)不超過6 h。綜上所述，基于核酸適體所建立的兩種檢測(cè)方法在靈敏度上稍弱于高效液相色譜法，但因?yàn)闄z測(cè)時(shí)間短，因此在大批量樣品篩查檢測(cè)中具有極大優(yōu)勢(shì)。

表7 基于核酸適體的檢測(cè)方法與高效液相色譜法檢測(cè)AFB1結(jié)果對(duì)比Table 7 Comparison of aptamer-based detection method and HPLC in the detection of AFB1

采用3種方法對(duì)不同加標(biāo)濃度的花生和玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表8和表9。當(dāng)花生加標(biāo)量為60 μg/kg時(shí)，酶聯(lián)適體法與適體轉(zhuǎn)換熒光法無顯著性差異，適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法無顯著性差異；當(dāng)花生加標(biāo)量為5、20 μg/kg時(shí)，3種方法之間均無顯著性差異。當(dāng)玉米加標(biāo)量為5、20、60 μg/kg時(shí)，3種方法之間均無顯著性差異。說明酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法用于檢測(cè)AFB1是可行性。

表8 3種方法對(duì)不同加標(biāo)濃度的花生中AFB1的檢測(cè)結(jié)果Table 8 Detection result of AFB1 in peanuts by three methods μg/kg

表9 3種方法對(duì)不同加標(biāo)濃度的玉米中AFB1的檢測(cè)結(jié)果Table 9 Detection result of AFB1 in corns by three methods μg/kg

3 結(jié)論

將酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測(cè)AFB1進(jìn)行了比較，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得知：3種檢測(cè)方法均呈現(xiàn)較好的回收率，酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測(cè)玉米中AFB1的結(jié)果相比無顯著性差異(P>0.05)，表明基于核酸適體酶聯(lián)適體法和適體轉(zhuǎn)換熒光法是可行的，且檢測(cè)時(shí)間短，在大批量樣品篩查檢測(cè)中具有極大的優(yōu)勢(shì)。