齊詩儀，張志燦，林 燊，章思佳，林麗莉，林 棟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院 福州 350122）

脆性X 綜合征（Fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是脆性X智力低下基因(Fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1)發(fā)生突變引起FMR1 mRNA 低表達(dá)或不表達(dá)，導(dǎo)致患兒出現(xiàn)中度或重度的智力障礙。目前FXS 尚無有效療法，產(chǎn)前診斷和選擇性流產(chǎn)是其主要的預(yù)防手段。因此，越來越多的研究者關(guān)注到了傳統(tǒng)針灸療法，其通過體表干預(yù)從而改善精神類疾病[1]?！峨y經(jīng)·二十八難》云：“督脈者…上至風(fēng)府，入屬于腦”。說明督脈與腦聯(lián)系密切，故有“病變在腦，首取督脈”之言。本課題組在前期臨床研究中通過針刺小兒腦性癱瘓伴智力低下患兒的督脈絡(luò)穴、初始之處—長強(qiáng)穴，發(fā)現(xiàn)其對改善患兒認(rèn)知功能障礙具有顯著的療效[2]。同時(shí)，在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本課題組通過研究與FRX 患者具有相似特征，精神發(fā)育遲滯的重要?jiǎng)游锬Ｐ虵MR1 基因敲除小鼠[3-4]，發(fā)現(xiàn)針刺長強(qiáng)穴分別影響了海馬、皮質(zhì)、小腦等不同腦區(qū)的相關(guān)蛋白表達(dá)量改變，從而改善突觸可塑性[5-7]。那么，針刺長強(qiáng)穴所引起的不同腦區(qū)間的整體效應(yīng)又是如何？故本研究擬通過觀察FMR1基因敲除小鼠海馬、皮質(zhì)、小腦的不同腦區(qū)之間環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、磷酸化CREB(p-CREB）蛋白的表達(dá)情況，以進(jìn)一步研究針刺的腦功能效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將FMR1 基因敲除小鼠（美國The Jackson Laboratory 公司）進(jìn)行配種與繁殖，并采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）檢測技術(shù)測定新生小鼠的基因表型，選擇純合子基因型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級房間（許可證號：SYXK（閩）2014-001）。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵照科技部［2006］398 號《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》文件要求執(zhí)行。

1.2 試劑與儀器

水合氯醛（福州邁新生技術(shù)開發(fā)有限公司）；華佗牌0.5寸針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司）等。

1.3 方法

1.3.1 PCR鑒定動(dòng)物基因表型

對通過配種繁殖所得的48 日齡新生小鼠進(jìn)行頜下靜脈叢采血。在血液樣品種加入Buffer TBP（血液樣品：Buffer∶TBP=1∶2），充分搖勻后離心去上清，加入TE Buffer 離心去上清數(shù)次。在沉淀物中加入Buffer Digestion 和Proteinase，震蕩混勻后進(jìn)行56℃水浴1 h。樣品加入Buffer PR 混勻后放置-20℃冰箱20 min。隨后將樣品室溫離心取上清，在上清液中加異丙醇混勻后室溫靜置，后離心去上清。75%乙醇清洗后室溫離心去上清，重復(fù)兩次后室溫靜置10 min，加入TE Buffer并提取DNA。將提取的DNA 進(jìn)行1%瓊脂糖電泳（150 V、100 mA 20 min）并于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中拍照觀察。FMR1基因敲除小鼠可擴(kuò)增出350 bp 的DNA片段，雜合子可擴(kuò)增出350 bp和180 bp的DNA 片段，引物序列見表1。

1.3.2 動(dòng)物分組與干預(yù)方法

將通過PCR 技術(shù)篩選出純合子基因敲除小鼠，隨機(jī)分成三個(gè)組，每組8 只。（1）空白組僅模擬抓取動(dòng)作。（2）非經(jīng)非穴組選擇肋弓最低點(diǎn)上1 cm 作為干預(yù)部位。（3）長強(qiáng)組根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]小鼠長強(qiáng)穴位于尾根與肛門之間的凹陷中。其中非經(jīng)非穴組與長強(qiáng)組使用自制雙極針，進(jìn)針約10 mm，并連接韓式電針儀，連續(xù)波，強(qiáng)度2 mA，頻率2 Hz，干預(yù)20 min。各組每天于固定時(shí)間進(jìn)行干預(yù)，一天一次，干預(yù)14 天。

1.3.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)

（1）于干預(yù)結(jié)束當(dāng)天采用水合氯醛對小鼠進(jìn)行腹腔注射，麻醉后對其進(jìn)行心臟灌注，隨后取出全腦進(jìn)行固定。（2）依次進(jìn)行不同濃度梯度酒精、二甲苯脫水、石蠟包埋。（3）將蠟塊切片、撈片和烘片。（4）將切片進(jìn)行脫蠟、透明、水化后進(jìn)行抗原修復(fù)。（5）使用純水沖洗切片三次后晾干，加入過氧化氫，室溫下孵育10 min。PBS 溶液沖洗三次，加入山羊血清，室溫下孵育 10 min。（6）去殘液加一抗，室溫下孵育 60 min。PBS溶液沖洗三次，加即用型快捷免疫組化試劑，室溫下孵育15 min。PBS 溶液沖洗三次，去殘液加LDAB顯色液，室溫下孵育5 min。顯微鏡觀察后用純水洗凈，蘇木素復(fù)染，PBS 沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究使用SPSS 22.0軟件分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得的數(shù)據(jù)以()表示，組間比較采用單因素方差分析及最小顯著差法（LSD-t），并對不同腦區(qū)的各指標(biāo)變化采用輪廓分析，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR基因鑒定結(jié)果

圖1泳道可見400 bp目的片段，為純合子小鼠，即FMR1 基因缺失。而雜合子小鼠泳道為350 bp 和180 bp，即FMR1基因存在。

2.2 免疫組化法檢測

在光鏡下標(biāo)記細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿棕褐色的陽性反應(yīng)顆粒，為圓形或橢圓形且體積較大。

2.2.1 CREB在不同腦區(qū)的表達(dá)變化

圖1 PCR基因鑒定結(jié)果

不同腦區(qū)CREB 表達(dá)平均光密度值提示（見圖2質(zhì)的CREB 表達(dá)量較海馬（P<0.05，P<0.01）、小腦（P<0.05）顯著升高。

針對腦區(qū)與蛋白表達(dá)的交互作用分析，平行輪廓分析結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.094，P=0.002<0.01），表明各組CREB 表達(dá)在腦區(qū)變化輪廓不平行，即腦區(qū)的聯(lián)動(dòng)變化不一致，由圖2 可知空白組在三個(gè)腦區(qū)的CREB 呈現(xiàn)出不同于非經(jīng)非穴組、長強(qiáng)組的表達(dá)趨勢，即針刺組與非針刺組的在三個(gè)腦區(qū)之間行為模式不同。

2.2.2p-CREB在不同腦區(qū)的表達(dá)變化

圖2 各腦區(qū)CREB蛋白陽性目標(biāo)平均光密度比較（左）及輪廓分析結(jié)果圖（右）

圖3 各組小鼠三個(gè)腦區(qū)抗體陽性目標(biāo)平均光密度值比較（10X）

不同腦區(qū)p-CREB 表達(dá)平均光密度值提示（圖4和圖3）：空白組海馬的CREB 表達(dá)量較皮質(zhì)（P<0.05）、小腦（P<0.001）顯著升高；非經(jīng)非穴組與長強(qiáng)組在皮和圖5），空白組小腦的p-CREB 表達(dá)量較皮質(zhì)（P<0.01）、海馬（P<0.05）顯著升高；非經(jīng)非穴組小腦的p-CREB 表達(dá)量較海馬（P<0.01）顯著升高；長強(qiáng)組各腦區(qū)p-CREB表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05）。

針對腦區(qū)與蛋白表達(dá)的交互作用分析，平行輪廓分析結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.085，P=0.378＞0.05），表明各組p-CREB 表達(dá)的腦區(qū)變化輪廓相互平行—三組的腦區(qū)聯(lián)動(dòng)變化一致；重合輪廓分析結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.880，P=0.177＞0.05），表明各組p-CREB的腦區(qū)變化輪廓重合—各組間腦區(qū)聯(lián)動(dòng)變化程度一致；水平輪廓分析結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.870，P=0.001<0.05），表明各組p-CREB的腦區(qū)變化輪廓不水平—各組中三個(gè)腦區(qū)的蛋白表達(dá)不相等，其中小腦最高。

2.2.3p-CREB率在不同腦區(qū)的變化

圖4 各腦區(qū)p-CREB蛋白陽性目標(biāo)平均光密度比較（左）及輪廓分析結(jié)果圖（右）

圖5 各組小鼠三個(gè)腦區(qū)抗體陽性目標(biāo)平均光密度值比較（×10）

不同腦區(qū)p-CREB率提示（圖6），空白組與非經(jīng)非穴組在小腦的p-CREB 率較皮質(zhì)（P<0.001，P<0.01）、海馬（P<0.001，P<0.05）顯著升高；長強(qiáng)組在各腦區(qū)的p-CREB率無顯著性差異（P＞0.05）。

針對腦區(qū)與p-CREB 率的交互作用分析，平行輪廓分析結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.803，P=0.148＞0.05），表明各組p-CREB 率在腦區(qū)變化輪廓相互平行—三組的腦區(qū)聯(lián)動(dòng)變化一致；重合輪廓分析結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.465，P=0.109＞0.05），表明p-CREB 率在三個(gè)腦區(qū)表達(dá)輪廓重合—各組間腦區(qū)p-CREB 率程度基本一致；水平輪廓分析結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.126，P<0.001），表明p-CREB 率在各腦區(qū)變化輪廓不水平—各組中三個(gè)腦區(qū)p-CREB 率不相等，其中小腦最高。

圖6 各腦區(qū)p-CREB率比較（左）及輪廓分析結(jié)果圖（右）

3 討論

3.1 長強(qiáng)穴針刺效應(yīng)腦區(qū)的CREB表達(dá)特點(diǎn)

CREB 參與學(xué)習(xí)、長時(shí)程（Long-term potentiation，LTP）記憶的相關(guān)過程[9]，并介導(dǎo)了神經(jīng)的保護(hù)作用，其在成癮、抑郁、焦慮等方面發(fā)揮著不可忽視的作用[10]。同時(shí)，CREB 被認(rèn)為與早期海馬神經(jīng)干的分化、存活和遷移有關(guān)[11]，其核蛋白作為細(xì)胞內(nèi)酶信號級聯(lián)系統(tǒng)以及效應(yīng)基因的反式激活系統(tǒng)的關(guān)鍵信號樞紐，故大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)信號能激活CREB 使其磷酸化[12]，磷酸化的CREB以二聚體的形式與CRE目標(biāo)基因序列結(jié)合[13]，通過調(diào)控神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)及其誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，從而在組織細(xì)胞修復(fù)、再生中起重要作用[14]。故在針灸的腦功能效應(yīng)研究中CREB 逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。

3.1.1 皮質(zhì)

額葉皮質(zhì)作為認(rèn)知功能的核心區(qū)域，有學(xué)者[15]發(fā)現(xiàn)其在算術(shù)與第二語言流利性的研究中激活明顯。而本課題組前期研究表明針刺長強(qiáng)穴上調(diào)FMR1基因敲除小鼠皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、CREB 等相關(guān)蛋白表達(dá)[7]，并在淺針干預(yù)失眠患者的臨床研究中通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法提取到了額顳枕區(qū)的特征腦電圖（EEG）信號[16]。

3.1.2 海馬

作為重要的信息處理區(qū)域的海馬，其與認(rèn)知、情緒、行為、學(xué)習(xí)、記憶以及位置導(dǎo)航等功能密切相關(guān)[17]。故諸多研究者們在如抑郁癥等疾病研究中發(fā)現(xiàn)干預(yù)體表穴位能夠引起海馬區(qū)CREB的改變[18-19]，而本課題組在針刺FMR1基因敲除小鼠及端粒酶基因敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)研究中亦觀察到了海馬CREB 等相關(guān)蛋白表達(dá)量增加。

3.1.3 小腦

隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，研究[14]表明小腦涉及了語言、時(shí)間感以及空間記憶等認(rèn)知過程，因此越來越多的研究者們關(guān)注到了針刺對小腦及其與大腦之間關(guān)聯(lián)的影響。有學(xué)者[20]通過腦功能影像學(xué)觀察到針刺引起小腦的活動(dòng)變化，這與本課題組前期通過分子生物學(xué)技術(shù)觀察針刺長強(qiáng)穴對FMR1基因敲除小鼠小腦的影響變化結(jié)果一致[6]。同時(shí)，本課題組采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法觀察了針刺即刻與針刺后20 min小腦與扣帶回的影響[21]，其研究結(jié)果表明針刺增強(qiáng)p-CREB 蛋白表達(dá)，且該變化在小腦與扣帶回之間存在較為一致的時(shí)間變化規(guī)律。

有鑒于此，本研究通過采用多元統(tǒng)計(jì)分析手段對FRM1基因敲除小鼠皮質(zhì)、海馬及小腦的CREB及其磷酸化蛋白進(jìn)行研究，以揭示不同腦區(qū)之間針刺效應(yīng)的變化特征。

3.2 針刺長強(qiáng)多腦區(qū)聯(lián)動(dòng)效應(yīng)的研究

組化結(jié)果顯示長強(qiáng)組與非經(jīng)非穴組的皮質(zhì)CREB表達(dá)量均較海馬與小腦高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而空白組海馬區(qū)的CREB 表達(dá)量較皮質(zhì)與小腦高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)其輪廓分析結(jié)果進(jìn)一步說明了長強(qiáng)組、非經(jīng)非穴組同空白組在三個(gè)腦區(qū)中CREB 蛋白表達(dá)變化趨勢不平行（圖4）。有學(xué)者[22]利用血氧水平依賴功能磁共振成像(BOLD-fMRI)觀察到在靜息狀態(tài)時(shí)大腦存在著較試驗(yàn)狀態(tài)的高激活區(qū)域，該區(qū)域與海馬密切相關(guān)。這與本研究結(jié)果一致，在無干預(yù)狀態(tài)（空白組）fMR1 基因敲除小鼠海馬區(qū)CREB 表達(dá)量較其他腦區(qū)高。而針刺刺激（長強(qiáng)組、非經(jīng)非穴組）引起腦區(qū)的活動(dòng)狀態(tài)發(fā)生改變，形成以皮質(zhì)為高激活區(qū)域，小腦相對增高，海馬相對降低的腦功能活動(dòng)狀態(tài)。該結(jié)果亦與腦功能影像學(xué)研究結(jié)果相呼應(yīng)：針刺穴位引起左側(cè)額上回、小腦扁桃體等區(qū)域的負(fù)激活[20]。也就是說，本研究結(jié)果提示CREB 蛋白的表達(dá)量改變與腦功能影像學(xué)結(jié)果相仿，其對針刺刺激做出了響應(yīng)。然而效應(yīng)不同于響應(yīng)，產(chǎn)生響應(yīng)不一定具有效應(yīng)[23]，故而本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為其可能作為響應(yīng)蛋白與穴位效應(yīng)并無較密切關(guān)系。

在p-CREB 及其磷酸化率的輪廓分析的結(jié)果顯示空白組、非經(jīng)非穴組與長強(qiáng)組在三個(gè)腦區(qū)變化趨勢呈現(xiàn)重合而不水平，形成以小腦為高激活區(qū)域，海馬與皮質(zhì)相對較低的腦功能活動(dòng)狀態(tài)。方差分析結(jié)果進(jìn)一步顯示其在空白組與非經(jīng)非穴組呈現(xiàn)小腦較皮質(zhì)和（或）海馬顯著升高，但其在長強(qiáng)組中三個(gè)腦區(qū)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初步表明三組中磷酸化蛋白及其變化率的腦區(qū)變化趨勢基本一致，且小腦可能參與了認(rèn)知能力的加工處理過程，這與本課題組前期的針刺對小腦蛋白表達(dá)影響的結(jié)果一致[6]。同時(shí)，在腦區(qū)變化趨勢基本一致的前提下，在非穴位的組別中（即空白組與非經(jīng)非穴組）磷酸化蛋白（率）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而穴位組（長強(qiáng)組）差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示針刺長強(qiáng)可能出現(xiàn)穴位效應(yīng)，并通過蛋白磷酸化而體現(xiàn)。

3.3 穴腦功能效應(yīng)研究

近年來，針灸的腦功能效應(yīng)中樞聯(lián)動(dòng)機(jī)制研究逐漸成為了穴腦功能研究的熱點(diǎn)（圖7）。諸多研究者通過腦功能影像學(xué)技術(shù)探索針刺的腦功能中發(fā)現(xiàn)“功能連接(Functional connectivity)”現(xiàn)象[24]，即針灸作用于體表穴位產(chǎn)生療效并非由單一腦區(qū)完成，而是由多個(gè)腦區(qū)協(xié)同調(diào)節(jié)共同發(fā)揮作用[25]。同時(shí)，越來越多學(xué)者關(guān)注到了“大腦-小腦環(huán)路”是小腦參與認(rèn)知的基礎(chǔ)[26-27]，其動(dòng)態(tài)交互作用與短時(shí)空間記憶關(guān)系密切[28-29]。然而，通過檢測腦區(qū)之間血氧水平依賴從而判定時(shí)域相關(guān)性的腦功能影像學(xué)僅能提示針刺刺激體表的響應(yīng)腦區(qū)。同時(shí)，目前大多數(shù)采用分子生物學(xué)技術(shù)探索針灸穴腦效應(yīng)的研究多采用某一較有限的局部指標(biāo)，如某蛋白的表達(dá)、某遞質(zhì)的水平等，以及采用較為單一的方差分析以探尋效應(yīng)機(jī)制的差異中特定蛋白或基因的特異性響應(yīng)，或衡量針灸方案取得的效果，而缺乏對腦功能整體性效應(yīng)的分析。

故為進(jìn)一步對針刺腦功能效應(yīng)的時(shí)空變化特征進(jìn)行表述，本課題組前期研究采用了[16,21]多元統(tǒng)計(jì)分析方法對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行了提取與分析（圖8），從時(shí)間、空間等多維度、多角度對穴腦效應(yīng)進(jìn)行探索[30]。本研究通過采用輪廓分析對海馬、皮質(zhì)、小腦不同腦區(qū)之間的行為模式改變進(jìn)行了分析，并呈現(xiàn)其直觀的可視化結(jié)果。本課題組將該腦區(qū)間的行為模式改變稱之為多腦區(qū)聯(lián)動(dòng)效應(yīng)，即將空間、時(shí)間等因素作為研究參數(shù)，在針刺作用的某個(gè)（某幾個(gè)）時(shí)刻，不同腦區(qū)之間的激活模式及其累積效應(yīng)的呈現(xiàn)。不同于腦功能影像學(xué)顯示多個(gè)腦區(qū)響應(yīng)模式—即“有（無）”的“點(diǎn)亮”行為；腦功能聯(lián)動(dòng)效應(yīng)則涵蓋了針刺效應(yīng)“量”在不同腦區(qū)中的程度變化，凸顯了針刺后腦區(qū)之間的相對變化特征。同時(shí)，本研究采用大腦發(fā)育程度較成熟的48日齡小鼠，故其存在著對外界刺激更高的反應(yīng)狀態(tài)，擁有更強(qiáng)的腦區(qū)聯(lián)動(dòng)效應(yīng)。

本研究通過采用輪廓分析的方法對不同腦區(qū)之間的行為模式聯(lián)動(dòng)改變進(jìn)行了分析，并呈現(xiàn)其直觀的可視化結(jié)果。本研究結(jié)果初步表明針刺刺激可能通過影響CREB 表達(dá)使得fMR1 基因敲除小鼠形成以皮質(zhì)為高激活區(qū)域的腦功能活動(dòng)狀態(tài)。而針刺長強(qiáng)穴則引起p-CREB 表達(dá)量在三個(gè)腦區(qū)中特異性改變，提示其可能存在穴位效應(yīng)。未來，本團(tuán)隊(duì)計(jì)劃通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法對疾病、時(shí)間、空間等因素展開多角度、多維度的分析，以期豐富針灸的腦功能效應(yīng)中樞聯(lián)動(dòng)機(jī)制研究。

圖7 穴腦功能效應(yīng)研究框架及潛在策略

圖8 腦區(qū)聯(lián)動(dòng)效應(yīng)示意圖