国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

鉤端螺旋體引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究

2020-11-24 05:16郭卉董瑤佳張啟貴曾令兵
醫(yī)學(xué)信息 2020年20期
關(guān)鍵詞:炎癥反應(yīng)

郭卉 董瑤佳 張啟貴 曾令兵

摘要:目的? 研究鉤端螺旋體56601株、JDL03株和JDL10株刺激金黃地鼠腹腔巨噬細(xì)胞后炎癥因子的表達情況。方法? 分別采用鉤端螺旋體56601株、JDL03株與JDL10株感染金黃地鼠腹腔巨噬細(xì)胞后,取上清,采用ELISA法檢測3個細(xì)胞株中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。結(jié)果? 培養(yǎng)24 h后,感染56601株的金黃地鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平高于感染JDL03株和JDL10株,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論? 鉤端螺旋體56601株能在巨噬細(xì)胞中引起較強的炎癥反應(yīng),而JDL03株和JDL10株引起的炎癥反應(yīng)較輕,可用于后期篩選疫苗靶標(biāo)。

關(guān)鍵詞:鉤端螺旋體;巨噬細(xì)胞;炎癥反應(yīng)

中圖分類號:S855? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼:A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.016

文章編號:1006-1959(2020)20-0057-03

Study on Leptospira-induced Inflammation of Macrophages

GUO Hui1,DONG Yao-jia2,ZHANG Qi-gui1,ZENG Ling-bing3

(1.Department of Laboratory Medicine,the First People's Hospital of Jiujiang City,Jiujiang 332000,Jiangxi,China;

2.Department of Laboratory Medicine,Jiujiang Maternal and Child Health Hospital,Jiujiang 332000, Jiangxi,China;

3.the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,Jiangxi,China)

Abstract:Objective? To study the expression of inflammatory factors after Leptospira strain 56601, JDL03 strain and JDL10 strain stimulated the peritoneal macrophages of golden hamster.Methods? After infecting golden hamster peritoneal macrophages with Leptospira 56601, JDL03 and JDL10, the supernatant was taken and the expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the three cell lines was detected by ELISA level.Results? After 24 h of culture, the expression levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the peritoneal macrophages of golden hamster infected with 56601 were higher than those infected with JDL03 and JDL10,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion? The Leptospira 56601 strain could cause a strong inflammatory response in macrophages, while the JDL03 and JDL10 strains cause a milder inflammatory response, which could be used for later screening of vaccine targets.

Key words:Leptospira;Macrophages;Inflammation response

鉤端螺旋體(leptospira)簡稱鉤體,菌體呈細(xì)長、螺旋狀,可分為非致病性鉤體(又稱為腐生型鉤體)和致病性鉤體兩大類[1]。生活在天然地表水和土壤中的腐生型鉤體不會導(dǎo)致疾病,而包括問號鉤端螺旋體在內(nèi)的致病性鉤體能引起人及動物的鉤端螺旋體病[2,3],簡稱鉤體病,是一種全球性的人畜共患病,其在全世界各地都廣泛流行,同時在我國絕大多數(shù)地區(qū)也都有不同程度的流行,尤以降水量充足的長江中下游地區(qū)最為嚴(yán)重,是我國重點防治的傳染病之一[4]。鉤體病的臨床表現(xiàn)不盡相同,輕癥患者可只表現(xiàn)為感冒樣癥狀;而重癥患者則可出現(xiàn)肝、腎、肺等多臟器的出血性病變,甚至死亡[5]。目前,在致病性鉤體菌中已發(fā)現(xiàn)超過250種血清型,但對于鉤端螺旋體一直都缺乏有效的遺傳操作手段,導(dǎo)致鉤體病的關(guān)鍵致病因子還未完全闡明,本文通過研究鉤端螺旋體56601株[6]、JDL03株和JDL10株感染金黃地鼠巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的差異,旨在為進一步探究機體對控制鉤體感染的作用機制及后期篩選疫苗靶標(biāo)提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料? 問號鉤體56601株、JDL03株和JDL10株由上海交通大學(xué)病原生物學(xué)教研室提供;EMJH培養(yǎng)基購自美國Sigma公司;酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒如TNF alpha Human ELISA Kit試劑盒、IL-1βHuman ELISA Kit試劑盒和IL-6 Human ELISA Kit試劑盒均購自美國Thermofisher旗下eBioscience公司;主要儀器包括細(xì)胞培養(yǎng)箱、科華320全自動酶標(biāo)儀等。

1.2實驗細(xì)胞? 實驗細(xì)胞的提?。簩⑶鍧嵓壗瘘S地鼠(小鼠6~8 周,雌性,購自上海生物制品所)脫頸椎處死,并浸入75%乙醇中10 s,取出小鼠并瀝干,將其仰臥于不銹鋼方盤上,用注射器吸6 ml生理鹽水注入腹腔中,輕揉小鼠腹部2 min,使液體在腹腔內(nèi)充分流動,用眼科鑷提起小鼠下腹皮膚,使小鼠微傾向一側(cè),剪開腹部皮膚后在肌肉層剪開一個小口,用膠頭滴管將腹腔液吸出轉(zhuǎn)入離心管中。每只吸出量約4~5 ml。

1.3實驗細(xì)胞的培養(yǎng)? 在4 ℃條件下,將收集的清潔級金黃地鼠腹腔灌洗液以1000 r/min離心10 min,去上清液,加入高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液用細(xì)胞板計數(shù)。顯微鏡下計數(shù)巨噬細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至所需,接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶,37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h,充分貼壁后棄上清液,除去非粘附細(xì)胞再加入高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用[6]。

1.4方法? 取鉤端螺旋體56601株、JDL03株和JDL10株接種于EMJH培養(yǎng)基中[7],28 ℃培養(yǎng)5~7 d后將處于對數(shù)生長期的鉤體于室溫下8000 r/min離心15 min,用無菌PBS液重懸后在暗視野顯微鏡下計數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×108個/ml。雌性金黃地鼠腹腔注射1 ml 5%巰基乙酸鈉溶液,5 d后提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞1×105個接種于96孔板中,過夜培養(yǎng)[8]。將處于對數(shù)生長期的鉤體以MOI=100:1感染細(xì)胞,同時另將無菌PBS液0.1 ml加入已接種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的96孔板中作為對照組,24 h后取上清,分別用ELISA試劑盒檢測上清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平[9],所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法? 所有研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件、GraphPad Prism 8統(tǒng)計分析和作圖軟件處理,計量數(shù)據(jù)采用(x±s)表示,行t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

鉤端螺旋體56601株、JDL03株和JDL10株感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞24 h后TNF-α水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且56601株感染巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α高于JDL03株和JDL10株,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各株螺旋體刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β、IL-6水平高于對照組,且56601株誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6水平高于JDL03株和JDL10株,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);另外,DL03株和JDL10株感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞24 h后TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);見表1、圖1。

3討論

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體引起的威脅人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的常見人獸共患病。鉤體病在77 個國家和地區(qū)已經(jīng)有過報道,尤以水稻種植為主的廣大發(fā)展中國家更為盛行。目前,鉤體病每年約有500000 例的病例報道,致死率約10%。鉤體病的臨床癥狀可表現(xiàn)為輕重緩急不一;輕癥患者可只表現(xiàn)為感冒樣癥狀,而重者可出現(xiàn)肝、腎、肺等多臟器功能衰竭,甚至死亡。我國也是鉤體病的高發(fā)地區(qū)之一,主要集中在降水量相對充足的長江中下游地區(qū),如江西省、湖北省、四川省等省份[4]。自80年代后,我國鉤體病的發(fā)病率雖然處于逐年下降的趨勢,但是鉤體病疫區(qū)常常隨著洪水季節(jié)的到來而出現(xiàn)爆發(fā)疫點。世界衛(wèi)生組(WHO)為此建立了一系列的鉤體研究組織,對鉤端螺旋體的致病機制、疫苗和診斷靶點的開發(fā)等進行更加深入的研究[10]。近年來關(guān)于鉤體和鉤體病的相關(guān)報道在逐年增加。然而,由于一系列技術(shù)上的局限性,鉤體的研究一直缺乏一套行之有效的遺傳操作手段;在其他致病菌中普遍的體內(nèi)遺傳操作,都難以在致病性鉤體中實現(xiàn),導(dǎo)致了鉤體病的致病機制到目前為止還未完全闡明,從而阻礙了鉤體病高效安全疫苗的開發(fā)和防治。

感染致病性鉤端螺旋體的人表現(xiàn)出從無癥狀到嚴(yán)重或致命疾病的多種臨床表現(xiàn)。盡管目前鉤端螺旋體可以用分子生物學(xué)技術(shù)分為不同的種類,但用血清學(xué)方法分類仍然是常用的方法[11,12]。目前已報道的致病性血清型超過250種,不同血清型是否能引起不同程度的疾病仍存在疑問,鉤端螺旋體引起不同程度癥狀的能力可能涉及多種因素,如生物體的毒性和數(shù)量以及宿主因素等。對于鉤端螺旋體也一直都缺乏有效的遺傳操作手段,導(dǎo)致鉤體病因尚未完全闡明,其診斷和疫苗也缺乏有效的免疫靶標(biāo)[11]。巨噬細(xì)胞能夠參與機體的特異性和非特異性的免疫反應(yīng),當(dāng)機體出現(xiàn)受損的組織或者細(xì)胞時,巨噬細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子[13,14]。目前已有許多不同鉤端螺旋體毒株誘發(fā)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的相關(guān)研究[15]。

TNF-α是一種能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、誘發(fā)炎癥并調(diào)控細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子,它是整個炎癥反應(yīng)過程中最早產(chǎn)生的諸多細(xì)胞因子之一,其主要由激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,它的產(chǎn)生可以誘導(dǎo)和促進B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體,進而引起炎癥反應(yīng)。有許多的研究表明很多疾病的進展都和高水平的TNF-α生物活性相關(guān)[10]。IL-1β是一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的參與炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),它是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的過程中一個主要環(huán)節(jié),IL-1β有著極其重要的生物學(xué)功能,主要參與抗原呈遞、細(xì)胞生長、炎性反應(yīng)等過程。局部低濃度的IL-1β可以促進T細(xì)胞的活化,誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖和抗體分泌[16]。IL-6是一種能夠廣泛參與機體免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子,其主要由纖維母細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、以及多種瘤細(xì)胞所分泌產(chǎn)生,并且能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能[17]。本次研究結(jié)果顯示,對照組以及鉤端螺旋體56601株、JDL03株和JDL10株均能夠刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6,其中對照組產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平較低;感染56601株的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平高于感染JDL03株和JDL10株以及對照組的水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而感染JDL03株和JDL10株的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);說明鉤端螺旋體56601株的毒力強于JDL03株和JDL10株,而鉤端螺旋體JDL03株與JDL10株之間的毒力差異不顯著。此結(jié)果為研究鉤端螺旋體56601株的表面暴露蛋白質(zhì)組和后期篩選問號鉤端螺旋體保守的表面抗原,并對其進行相應(yīng)的保護性驗證,以及為問號鉤體免疫靶標(biāo)的篩選[18]提供一定的依據(jù)。

綜上所述,鉤端螺旋體56601株能在巨噬細(xì)胞中引起較強的炎癥反應(yīng),而JDL03株和JDL10株引起的炎癥反應(yīng)較輕,可用于后期篩選疫苗靶標(biāo)。

參考文獻:

[1]Adler B.History of Leptospirosis and Leptospira[J].Current Topics in Microbiology&Immunology,2015(387):1.

[2]Fernandes LG,Siqueira GH,Teixeira ARF,et al.Leptospira spp:Novel insights into host-pathogen interactions[J].Veterinary Immunology&Immunopathology,2015:S0165242715300271.

[3]Levett PN.Leptospirosis[J].Clinical Microbiology Reviews,2001,14(2):296.

[4]羅依惠,吳亦斐,Munyampundu JP.問號鉤端螺旋體過氧化物還原酶AhpC在氧化應(yīng)激中的功能研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2018,38(3):193-198.

[5]聶志文,梁振山,曾令兵.問號鉤體56601株外分泌蛋白功能研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2015(2):8-10,17.

[6]范仕郡,劉鑫,黃敏,等.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的快速提取及培養(yǎng)[J].局解手術(shù)學(xué)雜志,2015,24(2):8,130-131.

[7]潘敏楠,徐國英.鉤端螺旋體EMJH培養(yǎng)基實驗室應(yīng)用[J].中國人獸共患病學(xué)報,2020(4):317-319.

[8]范霞,夏碧麗,呂霖,等.小鼠巨噬細(xì)胞對鉤端螺旋體56606v和56606a的吞噬及炎癥應(yīng)答的比較研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2019,39(1):26-30.

[9]Aurélie M,Djelouadji Z,Lattard V,et al.Overview of laboratory methods to diagnose Leptospirosis and to identify and to type leptospires[J].International Microbiology the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology,2017,20(4):184.

[10]Garcia LE,de Araújo Junior EC,Melo LM,et al.Characterization of the microtranscriptome of macrophages infected with virulent,attenuated and saprophyte strains of Leptospira spp[J].Plos Neglected Tropical Diseases,2018,12(7):e0006621.

[11]Zeng LB,Zhuang XR,Huang LL,et al.Comparative subproteome analysis of three representative Leptospira interrogans vaccine strains reveals cross-reactive antigens and novel virulence determinants[J].J Proteomics,2015(112):27-37.

[12]Zeng L,Zhang Y,Zhu Y,et al.Extracellular proteome analysis of Leptospira interrogans serovar Lai[J].OMICS,2013,17(10):527-535.

[13]Cagliero J,Villanueva S,Matsui M.Leptospirosis Pathophysiology:Into the Storm of Cytokines[J].Front Cell Infect Microbiol,2018(8):204.

[14]Domingos RH,Pavanel EB,Nakajima E,et al.Resistance of mice to Leptospira infection and correlation with chemokine response[J].Immunobiology,2017,222(11):1004-1013.

[15]王銘,陳紅,劉英,等.問號鉤端螺旋體對THP-1和J774A.1細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的影響[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2016,36(12):894-899.

[16]Silva P,Lauretti-Ferreira F,Caldas DLM,et al.Phagocytosis of Leptospira by leukocytes from mice with different susceptibility to leptospirosis and possible role of chemokines[J].BMC Microbiol,2019,19(1):4.

[17]Hirano S,Zhou Q,F(xiàn)uruyama A,et al.Differential Regulation of IL-1beta and IL-6 Release in Murine Macrophages[J].Inflammation,2017,40(6):1933-1943.

[18]Nancy C,Emilia S,María FF,et al.Leptospira species promote a pro-inflammatory phenotype in human neutrophils[J].Cellular Microbiology,2019,21(2):e12990.

收稿日期:2020-05-26;修回日期:2020-06-08

編輯/錢洪飛

猜你喜歡
炎癥反應(yīng)
多巴胺聯(lián)合多巴酚丁胺聯(lián)合治療小兒重癥肺炎的效果和對炎癥反應(yīng)的影響
右美托咪定結(jié)合超聲技術(shù)對患者下肢手術(shù)中止血帶所致氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響
兩種皮瓣修復(fù)術(shù)治療手外傷軟組織缺損的臨床對比研究
血必凈注射液對改善嚴(yán)重多發(fā)傷患者預(yù)后作用的研究
中藥方劑對缺血性卒中患者血小板活化、內(nèi)皮功能、炎癥反應(yīng)的影響研究
益氣扶正法在膿毒癥患者中的治療及對血清核因子—κB活性變化的影響研究
右美托咪定對膿毒癥患者圍術(shù)期血漿中細(xì)胞因子的影響
中西醫(yī)結(jié)合治療重度燒傷膿毒癥的效果研究
研究谷氨酰胺對嚴(yán)重膿毒癥患者炎癥反應(yīng)以及免疫功能的影響
替米沙坦對冠心病合并輕度高血壓患者頸動脈內(nèi)膜中層厚度及炎癥因子的影響
泽普县| 莲花县| 北海市| 横峰县| 辽宁省| 信阳市| 松桃| 宁乡县| 永胜县| 晋城| 荣昌县| 永登县| 乌鲁木齐县| 丰镇市| 屯昌县| 永昌县| 巫溪县| 汝城县| 衡东县| 辉县市| 彰化县| 台中县| 铅山县| 皮山县| 宜章县| 临海市| 波密县| 霞浦县| 岳阳县| 龙游县| 公安县| 子洲县| 托克托县| 宝应县| 二连浩特市| 泸西县| 清水县| 龙口市| 博白县| 陆川县| 封开县|