王文靜，李春艷，邱 睿，武 禎，張 輝，李君利

(1.中國(guó)原子能工業(yè)有限公司，北京 100032；2.清華大學(xué) 工程物理系，北京 100084；3.同方威視技術(shù)股份有限公司，北京 100084；4.清華大學(xué) 粒子技術(shù)與輻射成像教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

質(zhì)子和重離子先進(jìn)放療技術(shù)在放射治療中的應(yīng)用越來越廣泛[1]。與傳統(tǒng)放療相比，質(zhì)子和重離子放療成本較高，但隨著精準(zhǔn)和個(gè)體化醫(yī)療概念[2]的提出，以及束流掃描技術(shù)的引入，質(zhì)子和重離子放療在物理和生物方面的優(yōu)勢(shì)更加突出。物理方面，質(zhì)子和重離子劑量深度分布存在布拉格峰，布拉格峰末端劑量迅速下降；生物方面，重離子有增強(qiáng)的生物效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[3]。但與此同時(shí)也帶來了如何準(zhǔn)確評(píng)估質(zhì)子和重離子生物效應(yīng)的挑戰(zhàn)[4]。

目前已有許多研究輻射致死效應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)。為預(yù)測(cè)輻射沉積能量與所致細(xì)胞死亡效應(yīng)之間的關(guān)系，基于放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，國(guó)際上建立了不同的細(xì)胞存活模型，包括現(xiàn)象性模型和機(jī)理性模型[5]?，F(xiàn)象性模型包括靶學(xué)說、線性平方(LQ)模型等。根據(jù)生物效應(yīng)，機(jī)理性模型分為基于DNA損傷的細(xì)胞存活模型和基于染色體畸變的細(xì)胞存活模型。國(guó)際上，基于DNA損傷的細(xì)胞存活模型以Stewart等[6]提出的修復(fù)-錯(cuò)誤修復(fù)-固定(RMF)模型為代表，基于染色體畸變的細(xì)胞存活模型以Ballarini等[7-9]提出的細(xì)胞死亡和染色體畸變生物物理分析(BIANCA)模型為代表。此外，McMahon等[10-11]針對(duì)細(xì)胞周期的不同階段，分別提出了基于DNA損傷和基于染色體畸變的細(xì)胞存活模型。 RMF模型將快速蒙特卡羅損傷模擬程序(MCDS)估計(jì)的雙鏈斷裂(DSB)產(chǎn)額作為模型的輸入?yún)?shù)，用于生物學(xué)參數(shù)α與β的計(jì)算，盡管一定程度上體現(xiàn)了輻射致細(xì)胞生物效應(yīng)的機(jī)制，但用RMF模型計(jì)算的β參數(shù)隨傳能線密度(LET)是單調(diào)增加的，而根據(jù)細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)得到的β參數(shù)隨LET有明顯的遞減趨勢(shì)。McMahon等在計(jì)算輻射所致DNA損傷時(shí)，不同粒子類型單位劑量的DSB產(chǎn)額采用與光子相同的值，合理性存在疑問。Ballarini等和McMahon等提出的基于染色體畸變建立的細(xì)胞存活模型，一方面對(duì)染色體畸變類型考慮的不全面，另一方面兩個(gè)模型都建立在雙著絲粒和染色體斷片等是獨(dú)立的基礎(chǔ)上，但不同類型的染色體畸變可能是不獨(dú)立的。因此，有必要建立更加合理、準(zhǔn)確的機(jī)理性模型。

本文使用納劑量生物物理蒙特卡羅模擬程序NASIC，模擬不同LET輻射所致細(xì)胞核內(nèi)不同類型染色體畸變的產(chǎn)額，分析染色體畸變產(chǎn)額隨LET變化的規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，建立基于染色體畸變的細(xì)胞存活機(jī)理模型。

1 NASIC程序DNA損傷修復(fù)模塊開發(fā)

納劑量生物物理蒙特卡羅模擬程序是為了模擬輻射對(duì)納米量級(jí)的生物大分子，如DNA、染色質(zhì)等產(chǎn)生的效應(yīng)而開發(fā)的蒙特卡羅模擬程序。目前國(guó)際上典型的納劑量生物物理蒙特卡羅模擬程序有亥姆霍茲慕尼黑-德國(guó)輻射環(huán)境健康研究中心(HMGU)的PARTRAC[12]、瑞典卡羅林斯卡學(xué)院(Karolinska Institute)開發(fā)的KURBUC[13]、歐洲核子中心(CERN)開發(fā)的GEANT4-DNA[14]、清華大學(xué)工程物理系輻射防護(hù)與環(huán)境保護(hù)研究室開發(fā)的NASIC[15]，等。其中，PARTRAC和KURBUC等僅限內(nèi)部研究或合作研究時(shí)使用，GEANT4-DNA是開源的程序，但其DNA損傷修復(fù)模塊正在開發(fā)中。

NASIC程序包括物理模塊、前化學(xué)模塊、化學(xué)模塊、幾何模塊和DNA損傷模塊[15]。NASIC幾何模塊建立了一個(gè)精確到DNA原子幾何的、處于G1期的人體淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核生物靶模型。該細(xì)胞核的直徑約11 μm，包含46條染色質(zhì)和2個(gè)核仁，總DNA含量約6.2 Gbp，具有DNA雙螺旋鏈、核小體、染色質(zhì)纖維單元、核基質(zhì)結(jié)合區(qū)等一系列DNA結(jié)構(gòu)。物理模塊模擬輻射粒子在細(xì)胞中的輸運(yùn)過程；前化學(xué)模塊模擬電離、激發(fā)水分子通過不同方式離解和熱能化，產(chǎn)生多種輻解化學(xué)自由基的過程；化學(xué)模塊模擬這些自由基擴(kuò)散并相互發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的過程；DNA損傷模塊判斷和統(tǒng)計(jì)輻射所致DNA的直接損傷和間接損傷，獲得DNA單鏈斷裂(SSB)、雙鏈斷裂(DSB)和堿基損傷(BD)的分布信息。

為進(jìn)一步模擬DNA受到輻射損傷后的修復(fù)過程，本文開發(fā)NASIC程序的DNA損傷修復(fù)模塊?？紤]到處于G1期的細(xì)胞對(duì)DSB的修復(fù)途徑主要為非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)，首先對(duì)DSB的NHEJ修復(fù)途徑進(jìn)行模擬建模，

根據(jù)修復(fù)結(jié)果，判斷和統(tǒng)計(jì)輻射所致染色體畸變類型及產(chǎn)額，然后對(duì)DNA損傷修復(fù)模擬結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.1 DNA損傷修復(fù)模塊開發(fā)

DNA損傷修復(fù)模塊對(duì)NHEJ修復(fù)的模擬可分為對(duì)DSB末端狀態(tài)變化的模擬、對(duì)DSB末端空間位移的模擬和對(duì)修復(fù)結(jié)果的判斷3個(gè)部分。

參考PARTRAC[16]，NASIC將DSB末端分為無余末端和帶余末端2類，若距離DSB末端20個(gè)堿基對(duì)(bp)內(nèi)存在BD或SSB，則判定為帶余末端。對(duì)于帶余末端，先逐個(gè)修復(fù)BD和SSB，最后再進(jìn)行DSB修復(fù)。NASIC對(duì)無余末端和帶余末端的狀態(tài)改變流程的模擬示于圖1，其中，無余DSB末端的狀態(tài)從C1到C8，帶余DSB末端的狀態(tài)從D1到D8，修復(fù)過程從步驟1到步驟11。圖中，每個(gè)步驟對(duì)應(yīng)的數(shù)字為該步驟的狀態(tài)改變時(shí)間常數(shù)，用于計(jì)算該步驟DSB末端的狀態(tài)改變概率。

圖1 DNA修復(fù)模型中無余末端和帶余末端的狀態(tài)改變流程Fig. 1 State change process of clean DNA end and dirty DNA end in DNA repair model

ξi=1-exp(-δt/τi)

(1)

式中：δt為時(shí)間步長(zhǎng)，NASIC中取0.01 s，即每隔0.01 s對(duì)每個(gè)DSB末端進(jìn)行1次狀態(tài)改變的判斷；τi為步驟i的狀態(tài)改變時(shí)間常數(shù)，s；ξi為單位時(shí)間步長(zhǎng)下任一DSB末端經(jīng)歷步驟i從當(dāng)前狀態(tài)變?yōu)橄乱粻顟B(tài)的概率。

具體修復(fù)過程如下。

步驟1：DSB剛形成時(shí)，染色質(zhì)纖維會(huì)進(jìn)行解壓縮，斷點(diǎn)處的螺旋被打開，暴露出斷裂末端，使修復(fù)酶有空間依附。

步驟2：帶余末端會(huì)招募其他修復(fù)蛋白，阻斷了NHEJ酶Ku70和Ku80的結(jié)合。

步驟3：這種阻斷性結(jié)合會(huì)持續(xù)一段時(shí)間，然后恢復(fù)。

步驟4：Ku70和Ku80首先連接到DSB末端。

步驟5：Ku70和Ku80會(huì)有一定的可能從DSB末端脫離。

步驟6：DNA-PKcs結(jié)合到DNA的末端，與Ku70和Ku80形成DNA-PK復(fù)合物。

步驟7：DNA-PK復(fù)合物有一定的可能從DSB末端脫離，DSB末端回到?jīng)]有酶連接的狀態(tài)。

步驟8：兩個(gè)末端距離小于100 nm時(shí)，DNA-PK復(fù)合物將兩個(gè)末端連接起來，末端之間形成聯(lián)會(huì)復(fù)合物。

步驟9：DNA-PK復(fù)合物交叉磷酸化，NHEJ修復(fù)酶連接并激活。

步驟10：帶余末端臨近的SSB和BD被逐一修復(fù)，SSB的修復(fù)概率和BD的修復(fù)概率不同；帶余末端變?yōu)闊o余末端后，才可進(jìn)行后續(xù)修復(fù)。

步驟11：2個(gè)末端再連接，1個(gè)DSB被清除。

NASIC將DSB末端的空間位移模擬為在球形空間的半自由擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。球形空間的圓心為距離DSB末端最近的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)的中心。球形空間的半徑為DSB末端和核基質(zhì)結(jié)合區(qū)中心之間染色質(zhì)纖維的長(zhǎng)度。伴隨著解螺旋過程，染色質(zhì)纖維的長(zhǎng)度會(huì)以解螺旋速度5 nm/1 000 s[17]隨時(shí)間線性增加。DSB末端位移的大小采用擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算，位移的方向?yàn)楦飨蛲?。?lián)會(huì)前擴(kuò)散系數(shù)為170 nm2/s，聯(lián)會(huì)后擴(kuò)散系數(shù)為17 nm2/s[18]。

NHEJ修復(fù)過程結(jié)束后，對(duì)染色體畸變的類型和產(chǎn)額進(jìn)行判斷和統(tǒng)計(jì)。目前NASIC判斷和統(tǒng)計(jì)的染色體畸變類型包括雙著絲粒、無著絲粒、染色體易位、著絲粒環(huán)，以及>3 Mbp的染色體斷片等(圖1)。

1.2 DNA損傷修復(fù)模塊驗(yàn)證

采用DNA損傷修復(fù)模塊，模擬不同射線類型所致DNA損傷的修復(fù)過程。通過將修復(fù)曲線、不同類型的染色體畸變產(chǎn)額的模擬值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)DNA損傷修復(fù)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

不同類型射線的修復(fù)曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比示于圖2。由圖2可看出，對(duì)于60Co γ射線[19-20]、4He離子[21]和14N離子[12]所致的DNA損傷，NASIC模擬的未修復(fù)DSB末端比例隨時(shí)間的變化趨勢(shì)均與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合得很好。

圖2 不同類型射線所致DNA損傷的修復(fù)曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較Fig.2 Comparison between modelled repair curves and experimental data of DNA damage induced by different types of particles

60Co γ射線[22]和238Pu α粒子[23]所致不同類型染色體畸變產(chǎn)額的模擬值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比示于圖3，其中，可見畸變包括雙著絲粒、無著絲粒、著絲粒環(huán)，以及>3 Mbp的染色體斷片。由圖3可看出，NASIC能較好地模擬不同類型射線所致不同類型染色體畸變的產(chǎn)額。

2 輻射所致染色體畸變產(chǎn)額的規(guī)律

采用NASIC模擬統(tǒng)計(jì)不同劑量60Co γ射線和不同LET質(zhì)子照射所致不同類型染色體畸變的產(chǎn)額，分析不同類型染色體畸變產(chǎn)額之間的關(guān)系、染色體畸變產(chǎn)額隨受照劑量的變化規(guī)律，以及相同劑量下染色體畸變產(chǎn)額與射線LET的關(guān)系。

2.1 不同類型染色體畸變產(chǎn)額之間的關(guān)系

不同類型染色體畸變產(chǎn)額(本文均指單個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)額)之間的關(guān)系如圖4所示。從圖4a可見，雙著絲粒產(chǎn)額和無著絲粒產(chǎn)額、染色體易位產(chǎn)額都存在顯著的線性關(guān)系：對(duì)于無著絲粒，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4；對(duì)于染色體易位，R2=0.997 0。從圖4b可見，盡管著絲粒環(huán)的產(chǎn)額很小，與>3 Mbp的染色體斷片產(chǎn)額存在量級(jí)上的差異，因此不確定度較大，但著絲粒環(huán)產(chǎn)額與>3 Mbp的染色體斷片產(chǎn)額也存在線性關(guān)系，R2=0.973 9。

圖3 輻射所致染色體畸變產(chǎn)額的模擬值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較Fig.3 Comparison between modelled values and experimental date of radiation-induced chromosome aberration yield

圖4 不同類型染色體畸變產(chǎn)額之間的關(guān)系Fig.4 Relationship among different types of chromosome aberration yield

2.2 染色體畸變產(chǎn)額的劑量-效應(yīng)關(guān)系

由于在染色體畸變類型中，雙著絲粒和無著絲粒、染色體易位有顯著的線性關(guān)系，著絲粒環(huán)與>3 Mbp的染色體斷片有明顯的線性關(guān)系，所以，在分析染色體畸變產(chǎn)額的劑量-效應(yīng)關(guān)系時(shí)，只需要分析雙著絲粒和>3 Mbp的染色體斷片的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

60Co γ射線和不同LET質(zhì)子照射下，雙著絲粒和>3 Mbp的染色體斷片的產(chǎn)額隨細(xì)胞受照劑量的變化示于圖5。由圖5可看出，當(dāng)細(xì)胞受到光子或較低LET射線照射時(shí)，雙著絲粒產(chǎn)額與細(xì)胞受照劑量呈線性平方關(guān)系；隨著射線LET的增大，雙著絲粒產(chǎn)額與細(xì)胞受照劑量呈線性變化趨勢(shì)。對(duì)于60Co γ射線和LET在27.6 keV/μm以下的質(zhì)子，>3 Mbp的染色體斷片產(chǎn)額與細(xì)胞受照劑量呈線性平方關(guān)系。

2.3 染色體畸變產(chǎn)額隨LET變化規(guī)律

輻照劑量為2 Gy和4 Gy時(shí)，雙著絲粒產(chǎn)額和染色體斷片產(chǎn)額隨LET的變化示于圖6。由圖6可看出，同一種染色體畸變類型在不同劑量下，產(chǎn)額隨LET的變化趨勢(shì)一致。相同劑量下，雙著絲粒產(chǎn)額隨LET的增加較明顯，而>3 Mbp的染色體斷片產(chǎn)額隨LET的增加則相對(duì)平緩。

圖5 不同類型染色體畸變產(chǎn)額隨細(xì)胞受照劑量的變化 Fig.5 Variation of chromosome aberration yield with irradiation dose

圖6 染色體畸變產(chǎn)額隨射線LET的變化Fig.6 Variation of chromosome aberration yield with LET of ionizing radiation

3 基于染色體畸變的細(xì)胞存活機(jī)理模型

基于對(duì)NASIC模擬得到的染色體畸變產(chǎn)額數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，建立細(xì)胞存活機(jī)理模型。模型考慮的染色體畸變類型包括雙著絲粒、無著絲粒、染色體易位、著絲粒環(huán)和>3 Mbp的染色體斷片。由于高LET的He離子以及原子序數(shù)更大的重離子導(dǎo)致的染色體畸變類型更復(fù)雜，所以本文提出的模型適用于光子、質(zhì)子和低LET的He離子。

假設(shè)輻射所致細(xì)胞核內(nèi)雙著絲粒產(chǎn)額為Ndic、無著絲粒產(chǎn)額為Nac、染色體易位產(chǎn)額為Ntr、著絲粒環(huán)產(chǎn)額為Nring、>3 Mbp的染色體斷片產(chǎn)額為Ndel，每種畸變類型對(duì)應(yīng)的致死概率分別為qdic、qac、qtr、qring和qdel。模型推導(dǎo)過程如下：

-lnS=Ndeath

(2)

Ndeath=qdicNdic+qacNac+qtrNtr+

qringNring+qdelNdel

(3)

考慮到無著絲粒和染色體易位與雙著絲粒的線性關(guān)系，有Nac=k1Ndic、Ntr=k2Ndic。同理，Nring=k3Ndel，將其代入式(3)得：

Ndeath=qdicNdic+k1qacNdic+k2qtrNdic+

qdelNdel+k3qringNdel=(qdic+k1qac+k2qtr)·

Ndic+(qdel+k3qring)Ndel=q1Ndic+q2Ndel

(4)

由式(2)和(4)可得：

S=e-(q1Ndic+q2Ndel)

(5)

其中：S為存活分?jǐn)?shù)；Ndeath為細(xì)胞核內(nèi)平均致死事件個(gè)數(shù)；q1為與雙著絲粒呈線性關(guān)系的這一類染色體畸變轉(zhuǎn)化為致死事件的概率；q2為與>3 Mbp的染色體斷片呈線性關(guān)系的這一類染色體畸變轉(zhuǎn)化為致死事件的概率。

4 細(xì)胞存活機(jī)理模型驗(yàn)證

4.1 模型參數(shù)擬合

本文以V79細(xì)胞為例，擬合基于染色體畸變的細(xì)胞存活機(jī)理模型的參數(shù)。采用NASIC模擬的雙著絲粒產(chǎn)額和染色體斷片產(chǎn)額作為模型輸入，細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為模型輸出，擬合式(4)中的模型參數(shù)，得到q1=0.868 5、q2=0.181 6。采用基于染色體畸變的細(xì)胞存活模型計(jì)算的V79細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[24-26]的比較示于圖7。由圖7可看出，對(duì)于X射線和不同LET的質(zhì)子，模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合得很好，相關(guān)系數(shù)R2=0.985 3。模型僅采用2個(gè)擬合參數(shù)，即可較好地模擬不同LET射線對(duì)細(xì)胞的致死效應(yīng)，且能較好地區(qū)分不同LET射線在細(xì)胞致死效應(yīng)上的差異。

圖7 V79細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的基于染色體畸變的模型模擬值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比Fig.7 Comparison between modelled data andexperimental data of cellular survival

4.2 模型驗(yàn)證

采用4He離子的細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)建立的細(xì)胞存活機(jī)理模型及參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。模型計(jì)算的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)與4He離子細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[27-28]的比較示于圖8。模擬值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)R2=0.931 1。可見，建立的模型也適用于4He離子，且能較好地區(qū)分不同LET射線在細(xì)胞致死效應(yīng)上的差異。

圖8 V79細(xì)胞基于染色體畸變的細(xì)胞存活模型驗(yàn)證結(jié)果Fig.8 Validation of proposed cellular survival mechanistic model with experimental data of V79 cell

4.3 與LQ模型的比較

本文建立的基于染色體畸變的細(xì)胞存活機(jī)理模型，不同劑量、不同品質(zhì)射線致死效應(yīng)的差異體現(xiàn)在所致染色體畸變產(chǎn)額的差異上。從圖5可知，對(duì)于光子和低LET射線，劑量較低時(shí)，染色體畸變產(chǎn)額與劑量呈線性平方關(guān)系，但由于細(xì)胞核內(nèi)染色體的數(shù)目一定，染色體畸變的產(chǎn)額不會(huì)隨劑量一直呈線性平方增加。圖9為NASIC模擬的60Co γ射線所致雙著絲粒產(chǎn)額隨細(xì)胞受照劑量的變化，劑量較低時(shí)，雙著絲粒產(chǎn)額隨劑量呈線性平方增加，隨著劑量的增加，雙著絲粒產(chǎn)額由線性平方增加變?yōu)榫€性增加。LQ模型中，細(xì)胞核內(nèi)平均致死事件個(gè)數(shù)隨劑量呈線性平方增加，而本文建立的細(xì)胞存活機(jī)理模型，細(xì)胞核內(nèi)平均致死事件個(gè)數(shù)隨劑量的變化由線性平方增加變?yōu)榫€性增加，從而避免了LQ模型在高劑量下對(duì)輻射致死效應(yīng)的過高估計(jì)。

圖9 60Co γ射線照射所致雙著絲產(chǎn)額隨劑量的變化Fig.9 Variation of dicentric yield induced by 60Co γ radiation with dose

CHO細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在高劑量X射線照射下，基于染色體畸變的細(xì)胞存活模型與LQ模型估算的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的對(duì)比示于圖10?？煽闯?，LQ模型在高劑量下會(huì)高估輻射的致死效應(yīng)，與LQ模型相比，文本建立的細(xì)胞存活機(jī)理模型在高劑量下與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[29-30]符合得更好。

5 結(jié)論

本文開發(fā)了NASIC程序的DNA損傷修復(fù)模塊，用于模擬DNA受到輻射損傷后的修復(fù)過程，從而得到不同類型射線、不同LET輻射所致細(xì)胞核內(nèi)不同類型染色體畸變的產(chǎn)額。在分析染色體畸變產(chǎn)額變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，建立了基于染色體畸變的細(xì)胞存活機(jī)理模型。該模型適用于光子、質(zhì)子和低LET的He離子所致離體細(xì)胞致死效應(yīng)的評(píng)估，避免了LQ模型在高劑量下對(duì)輻射致死效應(yīng)的過高估計(jì)，而且不同于LQ模型，該模型具有同種細(xì)胞的模型及參數(shù)適用于不同類型射線、不同LET射線的優(yōu)點(diǎn)。

圖10 高劑量X射線照射下本文模型與LQ模型估算的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的對(duì)比 Fig.10 Comparison of cell survival estimated by model in this paper and LQ model under high dose X-ray irradiation