周琳 楊明理 王博浯 趙毅 曾春平

1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州醫(yī)科大學(xué)第五臨床學(xué)院，廣東 廣州 510700 2. 遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563000

骨質(zhì)疏松是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，主要表現(xiàn)為骨密度減少，骨脆性增加，骨折發(fā)生率增高。骨質(zhì)疏松伴髖骨骨折患者5年內(nèi)的死亡率比預(yù)期高出20個(gè)百分點(diǎn)[1]。骨質(zhì)疏松以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松最為常見(jiàn)，這是因?yàn)榻^經(jīng)后雌激素不足會(huì)導(dǎo)致骨重塑不平衡，骨吸收作用大于骨形成，從而導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。防己諾林堿(Fangchinoline)是從防己科植物粉防己和盾狀輪環(huán)藤等植物的根部分離、純化的主要有效成分，為五環(huán)三萜皂苷，水溶性及穩(wěn)定性良好。研究表明，防己諾林堿具有多種藥理作用，包括抗炎[3]、抗氧化應(yīng)激[4]和神經(jīng)保護(hù)作用[5]。且其同源類似物漢防己甲素具有抑制破骨細(xì)胞活性和骨保護(hù)作用[6]。據(jù)此，推測(cè)防己諾林堿對(duì)骨質(zhì)疏松有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)用去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松模型探討防己諾林堿對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用，為骨質(zhì)疏松的臨床用藥提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物：防己諾林堿 (純度≥98%)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.2動(dòng)物：C57BL/6雌性小鼠40只，7周齡，體質(zhì)量約20 g，購(gòu)于重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2017-0003。所有小鼠在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.3試劑：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)、I型膠原羧基末端肽(CTX)及I型膠原氨基末端肽(NTX)ELISA試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。雌二醇購(gòu)自北京索萊寶公司。TRIZOL購(gòu)買于美國(guó)invitrogen公司，Real-time PCR反應(yīng)試劑SYBR?Premix Ex Taq購(gòu)于大連TaKaRa公司。

1.1.4儀器：Skyscan 1174微型計(jì)算機(jī)斷層掃描儀(Micro-CT，比利時(shí)Bruker公司)；Gen5型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組：將40只8周齡C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白(假手術(shù))對(duì)照組、模型(去卵巢)組、陽(yáng)性(雌二醇，E2)對(duì)照組、防己諾林堿組，每組各10只。

1.2.2造模及給藥：用10%水合氯醛將小鼠麻醉后，在兩側(cè)腹背部做0.5 cm切口，依次剝開(kāi)皮膚、腹肌、腹膜、脂肪團(tuán)，切除雙側(cè)卵巢?？瞻?假手術(shù))對(duì)照組僅切除卵巢附近的同體積脂肪組織，余操作同卵巢切除小鼠。手術(shù)恢復(fù)1周后開(kāi)始給藥，防己諾林堿組隔日經(jīng)腹腔注射1 mg/kg防己諾林堿。陽(yáng)性(雌二醇)對(duì)照組隔日經(jīng)腹腔注射50 ng/kg雌二醇?？瞻讓?duì)照組和模型組注射相同劑量的生理鹽水。

1.2.3體重測(cè)定：在小鼠行卵巢切除術(shù)(小鼠8周齡)時(shí)稱重一次，給藥中(小鼠12周齡時(shí))稱重一次，處死小鼠(小鼠16周齡)時(shí)稱重一次。記錄小鼠體重變化。

1.2.4小鼠血清鈣、磷、TRAcP、CTX、NTX的測(cè)定：手術(shù)8周后，將所有小鼠采用眼球摘除法取血，2 000 r/min離心10 min，取上層血清，放置于-80 ℃?zhèn)溆?。用ELISA試劑盒檢測(cè)血清鈣、磷水平及TRAcP、CTX、NTX含量。

1.2.5骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)測(cè)定：手術(shù)8周后，處死小鼠，取一側(cè)股骨。用micro-CT檢測(cè)并分析小鼠股骨的骨小梁百分比(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.2.6小鼠骨組織骨質(zhì)疏松相關(guān)基因檢測(cè)：手術(shù)8周后，取小鼠另一側(cè)股骨，將小鼠股骨干骺端在液氮中研磨成粉，按照TRIZOL說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，從股骨干骺端提取RNA。用1μg 總RNA通過(guò)oligo-dT 引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)破骨細(xì)胞標(biāo)志基因的擴(kuò)增情況。引物設(shè)計(jì)如下：TRAcP (forward：5’-TGT GGCCATCTTTATGCT-3’；reverse：5’-GTCATTT CTTTGGGGCTT-3’)；Cathepsin K (forward：5’-GGG AGAAAAACCTGAAG-3’；reverse：5’-ATTCTGG GGACTCAGAGAGC-3’)；NFATc1 (forward：5’-CAA CGCCCTGACCACCGATAG-3’；reverse：5’- GGC TGCCTTCCGTCTCATAGT-3’)；CTR (forward：5’-TGGTTGAGGTTGTGCCCA-3’；reverse：5’-CTCGT GGGTTTGCCTCATC-3’)；GAPDH (forward: 5’-ACC ACAGTCCATGCCATCAC-3’；reverse：5’-TCCA CCACCCTGTTGCTGTA-3’)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 防己諾林堿對(duì)OVX小鼠體重的影響

在小鼠行卵巢切除術(shù)即小鼠8周齡時(shí)，各組小鼠體重?zé)o明顯區(qū)別。在給藥中即小鼠12周齡時(shí)，模型組較空白對(duì)照組體重上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組體重差異無(wú)明顯區(qū)別。處死小鼠即小鼠16周齡時(shí)，模型組及防己諾林堿組較空白對(duì)照組體重明顯上升，E2組體重較模型組顯著下降，防己諾林堿與模型組體重?zé)o明顯差異，E2組與空白對(duì)照組體重?zé)o明顯差異(表1)。

表1 防己諾林堿對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effect of fangchinoline on mice weight g)

2.2 防己諾林堿對(duì)OVX小鼠骨質(zhì)疏松相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)的作用

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，各組之間血清鈣、磷水平無(wú)顯著差異。與模型組相比較，防己諾林堿組及E2組TRAcP、CTX和NTX水平顯著降低。與空白對(duì)照組相比，防己諾林堿組及E2組的TRAcP、CTX和NTX含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 防己諾林堿對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松血清學(xué)指標(biāo)的作用Table 2 Effects of fangchinoline on osteoporosis related biomarkers in mice

2.3 防己諾林堿對(duì)OVX小鼠骨量流失的作用

Micro-CT結(jié)果顯示，與模型組相比較，防己諾林堿組及E2組BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著升高，Tb.Sp明顯降低。與空白對(duì)照組相比，防己諾林堿組及E2組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th及Tb.Sp差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，表3)。

表3 防己諾林堿對(duì)去卵巢小鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)的作用Table 3 Effects of fangchinoline on femoral microarchitecture in ovariectomized

圖1 防己諾林堿對(duì)去卵巢小鼠股骨近端骨微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of fangchinoline on femoral microarchitecture in ovariectomized mice

2.4 防己諾林堿對(duì)OVX小鼠骨組織骨質(zhì)疏松相關(guān)基因的作用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與模型組相比較，防己諾林堿組及E2組破骨細(xì)胞標(biāo)志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)顯著降低。與空白對(duì)照組相比，防己諾林堿組及E2組的破骨細(xì)胞標(biāo)志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (表4)。

表4 防己諾林堿對(duì)小鼠骨組織骨質(zhì)疏松相關(guān)基因的作用Table 4 Effects of fangchinoline on osteoporosis related genes expression in

3 討論

骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。骨重建包括骨形成和骨吸收兩個(gè)相互平衡的過(guò)程，分別由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞調(diào)控，當(dāng)破骨細(xì)胞的骨吸收功能超過(guò)成骨細(xì)胞的骨形成，即引起骨質(zhì)疏松[7]。目前常用的骨質(zhì)疏松藥物有雙膦酸鹽和雌激素，然而這些抗骨質(zhì)疏松藥物各有缺點(diǎn)，例如雙膦酸鹽與下頜骨壞死及非典型股骨轉(zhuǎn)子下骨折風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；雌激素則會(huì)提高乳腺癌及子宮癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此，尋找有效安全的抗骨質(zhì)疏松藥物具有重要意義。中醫(yī)藥具有較高的安全性和有效性[9]，通過(guò)多個(gè)機(jī)制發(fā)揮對(duì)骨質(zhì)疏松的防治作用，例如具有類雌激素、抗氧化、抗炎癥反應(yīng)等作用，以及通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[10]。因此，中醫(yī)藥有望成為防治骨質(zhì)疏松的主要手段之一。

防己諾林堿是從防己科植物粉防己和盾狀輪環(huán)藤等植物的根部分離、純化的主要有效成分，為五環(huán)三萜皂苷，水溶性及穩(wěn)定性良好。研究表明，防己諾林堿具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種藥理作用[3-5]，提示防己諾林堿可能具有骨保護(hù)作用。雌激素能抑制破骨細(xì)胞功能，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞功能。絕經(jīng)導(dǎo)致的雌激素低下是誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的重要原因。去卵巢小鼠模型是模仿絕經(jīng)后婦女生理特征而設(shè)計(jì)的一種成熟的動(dòng)物模型，成功模擬了因雌激素缺乏而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松[11]。因此，本研究采用去卵巢小鼠模型研究防己諾林堿對(duì)骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)選取1 mg/kg濃度的防己諾林堿進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于空白對(duì)照組，去卵巢模型小鼠體重明顯升高，這是因?yàn)檩^低水平的雌二醇能導(dǎo)致體重增加；E2組體重較模型小鼠明顯下降，與空白組無(wú)明顯區(qū)別，這是雌激素替代的生理結(jié)果。防己諾林堿組體重也較空白對(duì)照組明顯升高，與模型組小鼠無(wú)明顯區(qū)別，說(shuō)明防己諾林堿對(duì)去卵巢導(dǎo)致的體重增加無(wú)明顯作用。經(jīng)防己諾林堿處理后，去卵巢小鼠骨吸收相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)TRAcP、CTX、NTX水平明顯下降；BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著升高，Tb.Sp明顯降低，E2組也有相似的結(jié)果。以上結(jié)果表明，防己諾林堿有提升骨量、改善骨質(zhì)疏松的作用，各組間血鈣和血磷含量無(wú)明顯區(qū)別。這可能是因?yàn)榇萍に乜梢砸种萍谞钆韵偌に?parathyroid hormone，PTH)[12]，降低血鈣，同時(shí)雌激素還可抑制骨鈣素，升高血鈣，因此雌激素對(duì)鈣磷代謝無(wú)明顯作用。同時(shí)去卵巢手術(shù)和防己諾林堿對(duì)鈣磷代謝也無(wú)明顯作用，因此各組血鈣和血磷無(wú)明顯區(qū)別。經(jīng)防己諾林堿處理后，去卵巢小鼠破骨細(xì)胞標(biāo)志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)表達(dá)水平明顯下降，提示防己諾林堿的骨保護(hù)作用可能與抑制破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能有關(guān)，其作用的具體分子機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究表明防己諾林堿對(duì)去卵巢引起的骨量流失具有保護(hù)作用，為其應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。