劉明明 呂南寧 許海燕 華臻 馬勇 黃桂成 程建

1.連云港市第二人民醫(yī)院，徐州醫(yī)科大學(xué)連云港臨床學(xué)院，江蘇 連云港 222000 2.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221000 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，江蘇 南京 210000 4.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221000

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的生活水平、飲食結(jié)構(gòu)得到了明顯的改變，因而老年性相關(guān)的慢性代謝性疾病如2型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等的發(fā)病率也隨之增加，這不僅降低了廣大中老年人生活質(zhì)量，也給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。我國作為世界第一人口大國，2型糖尿病的患病率在2017年統(tǒng)計已達10.4%，慢性微血管是2型糖尿病患者最常見的并發(fā)癥，而糖尿病腎病又是對糖尿病患者影響最大的慢性微血管疾病，其發(fā)病率高達20%左右[1]。糖尿病腎病不僅是終末期腎病的最主要原因[2]，同時也是糖尿病患者死亡的最重要原因[3-4]。大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者常常合并有骨質(zhì)疏松癥，其特征主要是各種原因?qū)е碌墓堑V物質(zhì)密度下降，骨骼強度受損，以及受到輕微外力即發(fā)生骨折，威脅著全世界數(shù)百萬中老年人的健康與生活[5-6]。所以鑒于糖尿病腎病的高發(fā)病率以及嚴(yán)重危害中老年人的健康，其與骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)系愈來愈受到人們的關(guān)注。然而目前卻鮮有對于糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制的研究，也沒有明確療效的治療手段來阻逆它的進展。因此建立成功的2型糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的動物模型對于研究糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及治療手段具有重要的意義。然而，目前卻缺少對糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的動物模型的建立方法與評價標(biāo)準(zhǔn)的研究，本文主要是研究糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的動物模型的建立方法以及對建模成功的衡量標(biāo)準(zhǔn)進行探討，旨在為研究糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及治療手段提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 造模動物及試劑

此次研究實驗于2018年6月至2019年5月在徐州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心、連云港市第二人民醫(yī)院完成。實驗前已得到徐州醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理審批。

動物信息：隨機選擇雄性SD大鼠共70只，大鼠體重保持在(200±20) g，由徐州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：蘇SYXK2008-0034。

試劑：鏈脲佐菌素(STZ)來自于calbiochem公司購買。由徐州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心統(tǒng)一配置高糖高脂喂養(yǎng)飼料，其配方采用目前實驗經(jīng)典配方：常規(guī)飼料66．5%，豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鈉1%。

1.2 方法

1.2.1分組及處理：將70只正常SD大鼠隨機分為2組，造模組50只，正常組20只。造模組予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，同時飲用12%果糖水。正常組予以普通飼料喂養(yǎng)，飲用正常自來水。4周后禁食12 h，造模組大鼠和正常組大鼠分別予以左下腹一次性注射鏈脲佐菌素(35 mg/kg)和檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L)。兩組注射完成后繼續(xù)喂養(yǎng)4周，每周觀察兩組大鼠的尿量、進食量、飲水量、血糖以及體重。實驗結(jié)束時造模組大鼠血糖<16.7 mmol/L、尿糖為陰性、尿蛋白定量<20 mg/24 h予以剔除，不計入統(tǒng)計[7-8]。

1.2.2骨密度：使用乙醚吸入式全身麻醉對兩組大鼠進行全身麻醉，將麻醉后大鼠平躺于雙能X射線骨密度儀(DXA)探頭下，測量全部大鼠的骨密度(全身和左股骨)。

1.2.3生物力學(xué)實驗檢測骨強度：通過載荷-變形曲線可以獲得股骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)，通過應(yīng)力-應(yīng)變曲線可以獲得股骨的材料力學(xué)參數(shù)。采用股骨三點彎曲實驗方法，記錄載荷-變形曲線與應(yīng)力-應(yīng)變曲線。取出各組左側(cè)股骨，去除股骨表面附著的軟組織，各標(biāo)本在制作過程中均用生理鹽水紗布包裹。然后進行股骨生物力學(xué)測試，分別記錄股骨的載荷-變形與應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

1.2.4血及尿標(biāo)本觀察指標(biāo)：通過代謝籠收集大鼠24 h尿液，并進行24 h尿蛋白定量及尿肌酐(Ucr)等相關(guān)指標(biāo)檢測。內(nèi)眥取血，測定血肌酐(Scr)。依公式：Ccr=Ucr×24 h尿量/Scr計算Ccr。無水乙醚吸入麻醉后，開胸取心臟血，測定AST、ALB、ALT等生化指標(biāo)。采用分光光度法和ELISA法測定大鼠血清中骨代謝相關(guān)指標(biāo)：血Ca、血P、TALP、TRAP的變化。

1.2.5腎肥大指數(shù)：全部大鼠取雙腎，用電子天平稱重，腎肥大指數(shù)=腎重/體重。

1.2.6普通光鏡觀察：取大鼠右腎組織，固定在10%中性福爾馬林液中，石蠟包埋，切成3 μm厚的切片，脫蠟水化，并進行HE染色，然后使用普通光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等。取大鼠股骨，剔除多余肌肉等軟組織，將其固定甲醛(4%)溶液中，然后置于脫鈣液(水楊酸、蒸餾水、36%鹽酸、冰醋酸、)中脫鈣48 h。沿股骨矢狀面切成5 μm薄片，并進行HE染色。光學(xué)顯微鏡下，觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，如果組間比較則采用獨立樣本t檢驗分析，對于多樣本間比較則用方差分析方法，常規(guī)組間差異以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常組大鼠飲食、飲水無異常，大小便正常，精神狀態(tài)良好，活潑健壯，毛發(fā)有光澤，體重隨著周數(shù)的增加而增加，無死亡。造模組自注射鏈脲佐菌素2周后，大鼠明顯表現(xiàn)為精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，多飲、多食、多尿、體毛松散，活動減少，動作遲緩，部分出現(xiàn)腹瀉，便秘、腸梗阻的交替癥狀。實驗過程中，造模組1只大鼠因血糖不達標(biāo)被剔除，3只因尿蛋白不達標(biāo)被剔除。另外，造模組在腹腔注射鏈脲佐菌素成功后的4周內(nèi)先后有4只死亡，最后在第8周造模組成功造模糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠模型42只，造模成功率為84%。

2.2 體重、進食量、飲水量、腎重及腎肥大指數(shù)比較

建模之前，兩組大鼠間體重、進食量及飲水量差異無明顯差異性(P>0.05，見表1)，喂養(yǎng)8周建模成功后，造模組大鼠體重明顯低于正常對照組，造模組相較于正常組進食量與飲水量大幅度升高，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表1)。并且造模組腎臟肥大明顯，腎肥大指數(shù)顯著高于正常組，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

表 1 兩組大鼠實驗前后的體重、進食量及飲水量比較Table 1 Comparison of body weight, food intake, and water intake between the two groups before and after the experiment

表2 兩組大鼠第8周腎重及腎肥大指數(shù)比較

2.3 血糖、24 h尿量及尿蛋白的改變

實驗前兩組大鼠的血糖、24 h尿量及尿蛋白比較無明顯差異性(P>0.05，見圖1～3)，造模組予以高糖高脂喂食后，造模組的血糖及24 h尿量、尿蛋白逐漸增加，每2周所測得的血糖及24 h尿量、尿蛋白均較正常組增高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4周后造模組予以STZ注射后，造模組的血糖及24 h尿量、尿蛋白異常增高。

圖1 兩組大鼠不同時間段的血糖比較Fig.1 Comparison of blood glucose between the two groups in different time periods

圖2 兩組大鼠不同時間段24 h尿量比較Fig.2 Comparison of 24 h urine volume between the two groups in different time periods

圖3 兩組大鼠不同時間段24 h尿蛋白量比較Fig.3 Comparison of 24 h urinary protein between the two groups in different time periods

2.4 兩組大鼠第8周血、尿生化指標(biāo)的對比

第8周檢測兩組大鼠血Ca、P和尿Ca、P指標(biāo)，造模組血Ca、P明顯低于正常組血Ca、P，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表3)，且造模組尿Ca、P含量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表3)。

表3 兩組大鼠第8周血Ca、P和尿Ca、P比較

第8周檢測兩組血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)指標(biāo)，造模組血清肌酐、血尿素氮明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表4)，而造模組尿肌酐含量明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表4 兩組大鼠第8周Scr、BUN、Ucr指標(biāo)比較

第8周檢測兩組血清總堿性磷酸酶(TALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAR)指標(biāo)，造模組TALP、TRAR明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表5)。

表5 兩組大鼠第8周TALP、TRAR指標(biāo)比較

2.5 生物力學(xué)及骨密度對比

第8周取各組左側(cè)股骨，測量兩組的生物力學(xué)指標(biāo)，結(jié)果顯示造模組的極限載荷、彈性模量和彎曲強度均低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表6)。

表6 兩組大鼠第8周左側(cè)股骨的極限載荷、彈性模量和彎曲強度指標(biāo)對比

第8周采用雙能X線檢測兩組大鼠全身、股骨骨密度(見圖4)。與正常對照組大鼠相比，造模組大鼠的全身及左股骨骨密度均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表7)。

表7 兩組大鼠第8周全身及左股骨密度比較(g/cm2)

圖4 兩組大鼠X線掃描圖Fig.4 X-ray scan of rats in the two groups

2.6 大鼠腎、骨病理學(xué)觀測

正常組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)腎小球及腎小管形態(tài)基本正常；造模組大鼠腎小球基底膜變厚，系膜基質(zhì)擴張，腎小管出現(xiàn)空泡樣病變，足細(xì)胞足突大量融合，甚至脫落丟失。正常組大鼠骨小梁形態(tài)基本正常，骨小梁粗大、均勻，排列緊湊，互相連接成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，并且骨髓腔清晰，形態(tài)規(guī)整。造模組大鼠顯微鏡觀察骨小梁明顯稀疏，小梁之間的間隙變大，小梁變細(xì)，數(shù)量減少，連續(xù)性中斷，常見游離斷增多，骨髓腔增大，且呈不規(guī)則形態(tài)。見圖5。

圖5 兩組大鼠腎、骨組織HE染色觀察Fig.5 HE staining observation of the kidney and bone tissue in rats of the two groups

3 討論

隨著糖尿病腎病患者的病程進展，高血糖產(chǎn)生的滲透性利尿，使尿中鈣、磷等排出增加，從而引起機體內(nèi)骨代謝紊亂。長時間的尿糖升高會引起腎小管的病變，阻礙腎小管的重吸收，Ca、P排泄增多，血Ca、P減少，代償性的甲狀旁腺素分泌增多，增強破骨細(xì)胞活性，骨吸收增加，骨密度下降[9]。另一方面，糖尿病腎病患者體內(nèi)增多的糖基化終末產(chǎn)物，促進成骨細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致骨合成不足，骨量減少，骨組織的細(xì)微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，骨小梁數(shù)量逐漸變少、變細(xì)，并出現(xiàn)斷裂，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

隨著目前2型糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)病日益嚴(yán)峻，進一步防治該病，建立良好的2型糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的動物模型已經(jīng)迫在眉睫。既往的傳統(tǒng)研究主要集中在2型糖尿病腎病的動物模型，而對于并發(fā)骨質(zhì)疏松的2型糖尿病腎病的研究較少。傳統(tǒng)的2型糖尿病腎病動物模型的建立方法主要有3種，包括自發(fā)性、誘發(fā)性和轉(zhuǎn)基因動物模型。然而由于在自發(fā)性與轉(zhuǎn)基因動物模型發(fā)病過程中遺傳因素占據(jù)主導(dǎo)作用，這與臨床上糖尿病腎病的病理特點并不完全相符，且這種模型動物在我國來源有限、價格昂貴，極大地限制了相關(guān)研究的開展。誘發(fā)性動物模型中，三聯(lián)法(高能量飲食+STZ注射+單側(cè)或部分腎切除)雖然造模時間較短，具有顯著的生化、病理改變，但是存在操作復(fù)雜、容易感染、死亡率高的弊端[10]，因此，從價格、操作性、死亡率、成模率等方面考慮，誘發(fā)性動物模型中高能量飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的動物模型是目前較為理想的2型DN模型。高能量飲食(高糖、高脂、高糖高脂飼料)誘導(dǎo)胰島素抵抗，4周后再通過注射小劑量鏈脲佐菌素，從而破壞部分胰島β細(xì)胞，刺激胰島素分泌減少，從而形成2型糖尿病腎病模型[11]，此次實驗通過高能量飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗，聯(lián)合鏈脲佐菌素破壞部分胰島β細(xì)胞，第8周時成功建立糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松動物模型，成功率在84%。

臨床糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為持續(xù)的血糖、糖化血紅蛋白的升高，大量蛋白尿，并有飲水量多、尿量多和消瘦以及骨密度下降的癥狀。對于糖尿病腎病患者來說，尿蛋白的檢測是其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一，研究發(fā)現(xiàn)通過減少糖尿病患者的尿蛋白的排泄可以減少或者延緩糖尿病腎病的發(fā)生和病程進展[12-13]。不論是DN還是其他類型的腎病，蛋白尿與腎病的進展密切相關(guān)[14-15]。微量蛋白尿不僅是早期腎損傷的信號，出現(xiàn)微量蛋白尿時往往代表著患者腎小球已出現(xiàn)了廣泛損傷，其出現(xiàn)可增加患者的死亡率[16]。本次實驗中造模組在高糖高脂喂食后，尿量和尿蛋白逐漸增加，在第4周利用鏈脲佐菌素注射進行誘導(dǎo)后，造模組大鼠的尿量和尿蛋白與對照組相比，均明顯增高。隨著糖尿病腎病大鼠的腎功能逐漸下降，在第6周后，造模組大鼠的腎臟逐漸發(fā)生衰竭，尿量逐漸下降。在第8 周末，造模組大鼠的尿素氮、肌酐升高，體重增長緩慢，并且骨密度以及骨骼生物力學(xué)檢測明顯下降，符合糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的臨床特點。最后病理組織染色顯示正常組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)腎小球及腎小管形態(tài)以及骨小梁形態(tài)基本正常；造模組大鼠腎小球基底膜變厚，系膜基質(zhì)擴張，足細(xì)胞足突大量融合，甚至脫落丟失。造模組大鼠骨小梁明顯稀疏，小梁之間的間隙變大，小梁變細(xì)，數(shù)量減少，連續(xù)性中斷，常見游離斷增多，符合臨床糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的病理特點。

本研究的意義在于：選擇了模型大鼠的基礎(chǔ)指標(biāo)，包括血糖、體重、飲水量、尿量、尿蛋白、血脂、腎功能、骨密度及生物力學(xué)等，提供與臨床糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松的特點相符合的表現(xiàn)和數(shù)據(jù)性資料。表明STZ 誘導(dǎo)的糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松模型具有成?？斓奶攸c，6周時已有大量蛋白尿的腎損傷表現(xiàn)，與人類糖尿病腎病高度相似，在第8周時骨密度明顯下降，病情嚴(yán)重程度與病程相一致的特點。本研究成功建立了糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松動物模型，為深入研究糖尿病腎病并發(fā)骨質(zhì)疏松提供了基礎(chǔ)。